菌种保藏技术

1、菌种保藏技术根据菌种的生理生化特点,创造一个有利于其休眠或代谢活动处于最低的环境条件,即低温、干燥、缺乏氧气和养料,以及添加保护剂等,使微生物的代谢活动处于最低的状态,但又不至于死亡,从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求,应该选用不同的保藏方法。一般情况下,斜面保藏、半固体穿刺、液体石蜡保藏法和砂土管保藏法较为常用,也比较容易制作。（一）常规保藏方法1、斜面保藏法操作步骤：标记试管接种培养保藏将菌种转接在适宜固体斜面培养基上,待其充分生长后, 置4 冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存24个月移种1次,酵母菌间隔两个月,普通细菌1个月,假单胞菌两周传代1次

2、。2、半固体穿刺保藏法按穿刺接种方式培养菌种,菌种长好后用胶塞封严,置4 的冰箱存放。操作步骤：标记试管穿刺接种培养保藏。贴标签。取无菌的半固体肉汤蛋白胨直立柱数支,贴上标签,注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。穿刺接种。用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种,朝直立柱中央直刺至试管底部,然后又沿原线拉出。培养。置37 恒温箱中培养48h。保藏。半固体直立柱长好以后,放入4 的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。3、液体石蜡保藏法将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1cm为准,使菌种与空气隔绝。将试管直立,置低温或室温下保存。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不

3、死,酵母菌可保藏12年,一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌,在37温箱内,也可保藏3个月之久。优点：制作简单,不需特殊设备,且不需经常移种,还可防止干燥。缺点：保存时必须直立放置,所占位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意。4、砂土管保藏此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好,可保存几年时间,但对营养细胞效果不佳。操作步骤：河砂处理与土壤处理砂土混合灭菌无菌检查制各菌悬液加样干燥保藏。5、滤纸保藏法细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保

4、藏。前两者可保藏2年左右,有些丝状真菌甚至可保藏1417年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便,不需要特殊设备。将滤纸剪成0.5cm 1.2cm的小条,装入0.6cm 8cm的安瓿管中,每管12张,塞以棉塞,121 灭菌30min。将需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,充分生长。取灭菌脱脂牛乳(脱脂牛乳的处理：牛乳2000r/min离心10min脱脂,然后115 灭菌20min,或间歇灭菌3次,经检查无菌后备用)12mL滴加在灭菌培养皿或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。将安瓿管放入内有P2O5作吸水剂的

5、干燥器中,用真空泵抽气至干。将棉花塞入管内,用火熔封,保存于低温下。需要使用菌种,复活培养时,可将安瓿管口在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破裂,再用镊子敲掉口端的玻璃,待安瓿管开启后,取出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养。（二）真空冷冻干燥保藏方法利用有利于菌种保藏的一切因素,先将微生物在极低温度(-70 左右)下快速冷冻,然后减压下利用升华现象除去水分(真空干燥),使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下,因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。适用于菌种长期保存,一般可保存数年至十余年。但设备和操作都比较复杂。操作流程：准备安瓿管准备脱脂乳准备菌种制备菌悬液分装样品冷冻真空干燥封管存活性检测保藏活化。安瓿管先用2%HCl浸泡,再水洗多次,烘干。将标签放入