弧菌和气单胞菌的检验

1、弧菌和气单胞菌的检验一、弧菌属（Vibrio pacini, 1854）1、菌体大小与形态:G-，菌体短小，直或弯杆菌（0.5-0.8m 1.4-2.6m），以1根或几根极生鞭毛运动，无荚膜，无芽孢。2、培养特性与代谢特征:多数在普通培养基上生长良好；兼性厌氧，具呼吸和发酵两种代谢类型。所有的种可在25生长，多数在30生长。pH值6.0-9.0。Na+刺激所有种生长，并且为多数种所必需。氧化酶阳性。不产色或产黄色。可代谢D-葡萄糖和其他碳水化合物，产酸不产气。还原硝酸盐(产气弧菌、梅氏弧菌和病海鱼弧菌除外)。多数种发酵麦芽糖、甘露糖和海藻糖。多数对弧菌抑制剂O/129敏感。生态特性:发现于各种

2、盐度的水生生境，最常见于海、海岸、海面和海生动物的消化道，有的在淡水中也有发现。有的是人病原菌，有的对海洋脊椎和无脊椎动物致病。 最重要的人病原菌：霍乱弧菌（V.cholerea）可引起霍乱；副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）污染过的鱼和贝类引起人食物中毒；创伤弧菌（V.vulnificus）可引起高致死性的败血症。弧菌检验方法：（一）霍乱弧菌 (V. cholerae)分型：霍乱弧菌血清学分型生物学性状：革兰阴性 弯曲弧形或逗点状，首尾相接鱼群样平行排列单端极鞭毛，有普通菌毛和性菌毛悬滴观察：细菌运动，非常活泼，呈穿梭样或流星状。培养特性：霍乱弧菌检验方法：鉴别试验;霍乱红

3、试验、粘丝试验、O/129敏感试验、鸡红细胞凝集试验、多粘菌素B敏感试验、噬菌体裂解试验、耐盐培养试验霍乱红试验：粘丝试验：、O/129敏感试验鸡红细胞凝集试验多粘菌素B敏感试验噬菌体裂解试验V-P试验耐盐试验（二）副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）具嗜盐性，为海产鱼弧菌病的病原菌，一般在20-28引起鱼发病。人类食用或接触污染本菌的鱼、器具类等引致食物中毒。1、形态特征培养特性：系革兰阴性菌 呈弧状、杆状、丝状等形态。菌体一端有单鞭毛、运动活泼、无荚膜、无芽孢2、培养特性兼性厌氧,菌落中等大小，培养24h时直径约2mm。最适生长温度是30-37，42仍可生长。生长pH 5.

4、6-9.6(8.0)。代时10-20 min，增殖速度是大肠杆菌和志贺氏菌的2倍。多数菌株对弧菌抑制剂O/129不敏感，是弧菌属中少有的例外。生长繁殖时必须有钠离子。在含2.5% NaCl培养基上生长良好，不含NaCl的培养基不能生长，具嗜盐性。培养特征：绵羊血平板不溶血， TCBS琼脂上的菌落发绿, 利用甘露醇。临床意义：鉴定依据：致病性与毒力因子致病菌株多数能裂解人、兔等红细胞，可用溶血反应区分致病与非致病株，称为神奈川(Kanagawa)试验。溶血性菌株：产生耐热直接溶血素(Thermostable Direct Haemolysin, TDH)，属穿孔毒素，为不含糖或脂的蛋白质，MW3

5、2-44kD，与霍乱弧菌非01群及拟态弧菌产生的TDH相似。在神奈川试验阴性的菌株中，还发现一种不耐热的毒素磷酸脂酶A2，是本菌的毒力因子。人食用本菌污染的海鱼、贝类等常引致食物中毒，潜伏期2-36h，表现为水样腹泻、呕吐及发热，一般能很快康复。4、微生物学诊断取病变组织接种嗜盐菌选择培养基或SS平板。挑取可疑菌落进一步作生化试验，神奈川试验检测其毒素，也可用PCR技术检测毒素基因。由副溶血弧菌引起的对虾红腿病，可取病变组织50g，剪碎后加入50ml灭菌的氯化钠庆大霉素增菌液，增菌18 h，在液面下无菌吸取3ml菌液放入灭菌的试管，120,30min后进行斑点ELISA法快速检测，24 h内可

6、检出结果。疾病较严重时不经增菌也可检出。与鳗弧菌、溶藻弧菌等无交叉反应。二、气单胞菌属 (Aeromonas, Kluyver and van Niel, 1936)气单胞菌可分为运动性（motile）或嗜温性（mesophilic）及非运动性或嗜冷性两大类，前者以嗜水气单菌为代表，包括温和、豚鼠、凡隆、舒伯特、简达及易损气单胞菌等，其致病作用无明显区别。临床意义：气单胞菌为水中常居菌 可引起哺乳动物（如人、鸟类等）和冷血动物（如鲑、鱼、蛇等）的感染 在人类主要引起肠道内感染和肠道外感染气单胞菌常引起5岁以下儿童和成人的肠道内感染，是夏季腹泻的常见病原菌之一，其主要的致病物质为溶血毒素和细胞毒

7、素等。肠道外感染主要为皮肤和软组织感染，与外伤后伤口接触污染的水有关。2、形态及培养特性G-，从直杆菌到接近球状。单个，成对或短链。通常以一根极生鞭毛运动（固体培养幼龄时具周生鞭毛）。兼性厌氧。具呼吸和发酵两种代谢类型。最适生长温度22-28；多数种可在37生长，其它种最高生长温度38-41，最低0-5，pH5.5-9.0。气单胞菌形态特征：革兰阴性短杆菌，有时呈球状 绝大多数有极端单鞭 动力阳性兼性厌氧 营养要求不高，在普通培养基上可以生长，形成灰白色、光滑、湿润、凸起，2mm大小的菌落，在TCBS培养基上不生长。在0c-45c范围内均可以生长，根据生长温度的不同，可分为嗜冷菌（37c以上不

8、生长）和嗜温菌（10c-42c之间生长）两大类。嗜水和杀鲑气单胞菌与霍乱弧菌一样，存在所谓活的非可培养（viable but nonculturable ,VBNC）状态，实际上是一种休眠状态，其菌体缩小成球状，耐低温及不良环境，常规培养不生长。温度回升且获得生长所需的营养条件时，细菌回复到正常状态，重新具有致病力。3、生化性状对葡萄糖和其他糖类能产酸，常产气。氧化酶和触酶阳性。通常精氨酸水解酶阳性，鸟氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱氨酶阴性，尿酶阴性。明胶酶和DNA酶皆阳性。还原硝酸盐。多数种能发酵的糖包括麦芽糖、D-半乳糖和海藻糖。对抗菌抑制剂2，4二氨基6，7异丙基喋啶（O/129）不敏感。种属鉴

9、定：氧化酶阳性、触酶阳性、硝酸盐还原试验阳性、发酵葡萄糖和其它碳水化合物产酸或产酸产气。4、致病性及毒力因子具有毒力因子的菌株才有致病性。其毒力因子有3类：一是胞外产物，如毒素和蛋白酶；二是粘附素，如S蛋白、4型菌毛和外膜蛋白等；三是铁载体。5、微生物学诊断血平板、麦康凯平板或TSA培养基等可直接分离气单胞菌。从动物腹泻粪便分离则需采用RS选择培养基。分离菌为革兰氏阴性，氧化酶和触酶阳性。同时可凭O129等其它关键生化指标进行判定。分离株是否有致病性，则还需检测胞外蛋白酶和溶血素等毒力因子，可用脱脂奶平板和血平板划线培养，或用相应抗体建立的ELISA试剂盒检测。6 、常见种类嗜水气单胞菌（A.

10、hydrophila） 杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）（一）嗜水气单胞菌（A. hydrophila）1 形态与染色特性G-, 两端钝圆、直或略弯的短小杆菌，0.3-1.01.0-3.5 m，多数单个存在，少数双个排列。通常菌体一端有单鞭毛，幼龄培养在菌体四周形成鞭毛，但对数生长期过后，该细胞又呈极生单鞭毛。无荚膜，不形成芽孢。2 培养特性(1) 兼性厌氧。在普通琼脂、TSA、麦康凯琼脂、SS琼脂上生长良好，血平板溶血，TCBS或6% NaCl中不生长，对弧菌抑制剂O/129不敏感，一般不发酵乳糖。(2) 普通琼脂平板菌落: 直径2-3mm, 圆形、表面光滑、边缘整齐、中央隆起、灰

11、白色、半透明。(3) 在溴化十六烷基三甲铵琼脂上不生长。在TSA平板28培养18-24h，菌落呈淡黄褐色，无水溶性色素。(4) 最适生长温度28，最高38-41，一些菌株可在5生长，pH 6-11(7.2-7.4)，盐浓度0-4%(0.5%)。3 生化性状水解淀粉和精氨酸、发酵甘露醇、赤藓糖醇、棉子糖、果胶糖：+苯丙氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶、MR、V.P、氧化酶、触酶试验：+4 抵抗力水中常见菌，一般夏季较多、冬季减少。是鱼肠道菌群之一。鱼和动物分离株较环境分离株的蛋白质分解能力强。对热抵抗力较差，60-65,30min-1h死亡。 对氯霉素、土霉素、氟苯尼考、链霉素、四环素、磺胺嘧啶，硝基呋

12、喃等具抗性的菌株被筛选。从这些菌株分离到相应可转移抗药性质粒。5 抗原性运动性气单胞菌有O、H和K抗原运动性气单胞菌与杀鲑气单胞菌及其他属细菌也存在共同抗原成分6 致病性与致病因子嗜水气单胞菌对多种鱼、两栖类及爬虫有致病性，可引起鳗鲡赤鳍病、红点病、烂鳃病；鲤鱼和金鱼竖鳞病；鲢鳙鱼打印病；青鱼和草鱼肠炎；青鱼疖疮病；香鱼红口病；甲鱼“红脖子病”；蛙红腿病；蛇败血病和口炎。此外，还可导致鱼类败血症。称为运动性气单胞菌败血病。感染人类引致急性胃肠炎，是食品卫生检验对象。本菌主要通过肠道感染，鱼体受伤或寄生虫感染时可经皮肤和鳃感染，并与水温、有机质含量，饲养密度等密切相关。水温24-28死亡率较高，

13、10以下不发病。致病因子(1)毒素:包括溶血素及肠致病性毒素。溶血素分和2种。 溶血素能引起家兔注射局部的硬结、毛细血管充血和皮肤坏死，对Hela细胞、绿猴肾细胞、成纤维细胞和Y1肾上腺细胞具有毒性，可致动物败血性肠炎。 溶血素毒性较强，静注0.4g即可导致小鼠死亡，引起家兔皮肤坏死。 肠致病性毒素可分为3种，即霍乱样肠毒素、细胞兴奋型肠毒素和细胞毒肠毒素。(2)蛋白酶: 酪蛋白酶、纤维蛋白酶、胶原酶、葡萄球菌溶解素等,这些均与本菌的毒性有关。(3)外膜蛋白：与细菌的黏附相关。7 微生物诊断 细菌分离培养：TSA；生化试验：一般不分解乳糖，对O/129不敏感；葡萄糖产气，发酵甘露醇、蔗糖，利用

14、阿拉伯糖，水解七叶苷/水杨苷，鸟氨酸脱羧酶阴性。 致病因子：检测胞外蛋白酶、溶血素、外膜蛋白等；血清学检查：玻片/试管/微量凝集；动物感染试验。（二）杀鲑气单胞菌（A. salmonicida1 形态与染色特性 G-短小杆菌，长度不到宽度的两倍，0.8-1.01.0-1.8m，通常成双、短链或成丛状排列。无鞭毛、无动力、不形成芽孢和荚膜。2 培养特性兼性厌氧，生长需精氨酸和蛋氨酸。普通琼脂上22培养48h后，形成圆形、隆起、边缘整齐、半透明、松散菌落。多数菌株在含酪氨酸和苯丙氨酸的TSA、FA(Furunculosis agar,疖疮病琼脂)上产生水溶性褐色素，但厌氧下不能产生色素。血琼脂上快

15、速溶血，7天后菌落变成淡绿色。生长温度5-35(22-25)，生长pH6-9(7)，盐浓度0-3%3 生化特性阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、糊精、精氨酸水解：+山梨糖、山梨醇乳糖、棉子糖、纤维二糖：-KCN肉汤、7.5% NaCl营养肉汤生长：-氨基甲酰磷酸激酶脂酶、腺嘌呤3, 2-单磷酸激酶：+脲酶、鸟氨酸脱羧酶（ODC）和连四硫酸盐还原酶：-4 抵抗力本菌在蒸馏水存活4d至2w，灭菌河水28d（20-25）、灭菌湿土40d（20-30）不死亡。强毒株在含有机质淡水中可存活15w，在死鱼肾脏存活28d（4）、在海水中10d内死亡。对土霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、喹啉酮、噁啉酸等敏感。许多抗生素

16、只能抑制其繁殖，不能将其杀灭。5 抗原性杀鲑气单胞菌各亚种间具有共同的O抗原。此外，不产色亚种还具有亚种特有的抗原。 杀鲑气单胞菌与本属的其他种也存在共同抗原成分。6 致病性与致病因子 致病性：主要感染鲑科鱼类，为鲑科鱼类疖疮病病原。细菌通过患病鱼、带菌鱼和污染水水平传播。入侵门户主要是受伤皮肤，也可通过胃肠道和鳃感染。致病因子本菌病因与细胞壁表面的A层(additional cell surface layer; A-layer)和胞外产物(extracellular products; ECPs)有关。有毒菌株的细胞壁都有A层，主要由50kD的蛋白质组成，因此又称A蛋白层。A蛋白的氨基酸序

17、列类似于大肠杆菌的K88菌毛和胎儿弯杆菌的微荚膜，可吸附于宿主细胞。此外，还可帮助该菌获取铁离子，避免血液中补体的溶解和吞噬细胞的吞噬。有A层的菌体悬浮于盐溶液时往往产生自凝现象。这些菌株可凝集鲑鳟鱼类的红细胞，但不凝集鲤科鱼类和哺乳动物的红细胞。杀鲑气单胞菌的胞外产物（ECP）至少由25种蛋白构成。包括溶血素、鲑溶解素（salmolysin）、杀白细胞素、细胞性糖蛋白及酪蛋白酶、骨胶原酶等。7 微生物学检查（1）涂片镜检 取病鱼的血液、脏器等涂片，革兰氏染色，可见革兰氏阴性的短杆菌。（2）分离培养 取病鱼肾脏或体表溃疡的病健交界处组织，接种于TSA或FA平板，20-28培养，检查有无产褐色素的菌落并进