培养基质量保证与质量控制

1、培养基质量保证与质量控制培养基制备指南(SN/T1538)简介李卫华山西出入境检验检疫局技术中心微生物检检测的定定义在特定的的环境下（无菌），采用用适当的的方法对样品中中目标微生生物进行增殖殖和培养养，并对对经放大大后的目目标微生生物进行行感官、生理、生化等等方面的的特性分析和判判定，以确定样品中目目标微生生物的量和/或或质的特性的的过程。微生物检检测涉及及的要素素检测人员员检测经验验和判断断能力检测设备备保证目标标菌种的的生长的的外部环环境菌种试剂剂保证目标标菌种生生长的内内部环境境检测方法法选择适宜宜目标菌菌种检测测的方法法测试环境境保证操作作过程不不受外界界干扰（保护样样品和人人员）培养

2、基的的质量保保证与质质量控制制质量保证证quality assurance为使人们们能确信信某个产产品(这里只培培养基)能满足规规定的质质量要求求所必须须执行的的有计划划的和系统的活动提出质量要求求并制定系统的质质量控制制计划质量控制制quality control为达到质质量要求求所采取取的操作作技术和和活动为达到质质量要求求所采取取的具体的技技术操作作培养基制制备指南南：SN/T1538SN/T1538.1-2005(2005年7月1日实施)第1部分分:实验验室培养养基制备备质量保保证通则则提出要求求并制定定系统的的控制计计划属于质量量保证的的范围SN/T1538.2-2007(待发布)第

3、2部分分:培养养基性能能测试实实用指南南为保证提提出的质质量要求求所需要要采取的的技术操操作属于质量量控制的的内容标准制定定情况简简介SN/T1538.1修改采用用了ISO/TS11133-1：2000（E）(2000年6月月1日发发布)SN/T1538.1修改采用用了ISO/TS11133-2：2003（E）(2003年12月25日发发布)本标准的的作用SN/T1538为培养基基质量保保证和质质量控制制标准体体系，有利于对对培养基基的标准准化管理理，提高高实验室室检测质质量：第1部分分为质量量保证和和培养基基质量基基本要求求第2部分分为质量量控制技技术为CNAS合格评定定的微生生物实验验室认

4、证证工作提提供参考考依据重点讲解解内容相关术语语主要质量量保证要要求质量控制制方法质控菌株株培养基液体、半半固体或或固体形形式的，含天然然或合成成成分，用于保保证微生生物繁殖殖或保持持其活力力的物质质培养基类类型各别成分分培养基基Culture mediumpreparedfrom individualcomponents实验室用用不同的的化学和和/或生生物试剂剂按照一一定的配配方、比比例配置置而成的的培养基基即用型培培养基ready-to-usemedium以即用形形式置于于容器中中(例例如：平平皿、试试管或其其它容器器)供供应的培培养基。脱水合成成培养基基culture mediumpre

5、paredfrom commerciallydehydrated formulation.不立即使使用的干干粉形式式的(如如：粉末末、小颗颗粒、冻冻干等形形式)培培养基。标准的主主要内容容购置验收收要求(CNAS-CL01：4.6.2)生产企业业提供资资料实验室外外观检查查记录储存、使使用、弃弃置要求求（CL11：5.9)成品的质质量控制制(概述第2部分.重点为菌菌株)物理指标标:培养基外外观微生物指指标:重点提到到对测试试菌株的的要求SN/T1538.1常规质量量控制要要求物理指标标:外观控制制微生物指指标:污染;生长率;选择性;特异性(CNAS-CL01: 4.6.2;CNAS/CL11：

6、5.9)性能测试试方法举举例对质量控控制要求求的补充充说明和和详细实实例SN/T1538.2购置验收收要求生产企业业提供材材料：产品标签签：产品名称称、编号号批号使用前的的pH必要的安安全/危害数据据有效期技术数据据清单质控证书书性能评价价所用测试试菌株实验室验验收：产品标签签：名称和批批号有效期接收日期期包装及其其完整性性SN/T1538.1-2005中4.1;对应CNAS/CL014.6.2内容,通常要记记录(采购服务务和供给给)储存要求求例行常规规检查内内容:容器密闭闭性复查查首次开封封日期内容物的的感官检检查使用前检检查(即用型培培养基):颜色是否否发生变变化?是否蒸发发/脱水?是否有

7、微微生物生生长?注:SN/T1538.1:2005中4.2;对应CNAS/CL01:4.6.2内容,可不做记记录实验室自自制和使使用要求求培养基用用水称量和复复水溶解和分分装pH测定灭菌监测琼脂培养养基融化化培养基脱脱气添加成分分制备和和加入平板的制制备和储储存培养注:SN/T1538.1-2005中4.3-4.4内容,对应CNAS/CL11:5.9部分内容容,红色部分分通常需需做记录录培养基的的弃置要要求所有污染染和未使使用的培培养基的的弃置必必需采用用安全的的方式，并且要要符合相相关法律律法规的的规定。注:SN/T1538.1-2005中4.5内容,应符合CNAS/CL01:5.3.5(废

8、弃物处处理程序序)要求质量控制制基本要要求对培养基基的要求求分装数量量外观、色色泽和均均一性琼脂凝胶胶的硬度度水份含量量pH 缓冲能力力微生物污污染(即用培养养基)对基础成成分的要要求对不稳定定的生物物成分，使用时时可根据据情况调调整用量量。注:SN/T1538.2中对制造造商的要要求微生物学学要求微生物污污染生长特性性生长率选择性生理生化化特性选择性和和特异性性抗菌实验验特性红色部分分为对培培养基进进行质量量控制的的主要内内容生长率(定量测测试方法法)PR=NS/NONS：待测培培养基平平板上得得到的菌菌落总数数。N0：参考培养养基平板板上获得得的菌落落总数，应100cfu要求：非非选择性性

9、培养基基上目标标菌的生生长率最最低应为为0.7，该类培培养基应应易于目目标菌生生长；选选择性培培养基上上目标菌菌的生长长率最低低应为0.1 选择性(定量测试试方法)SF=DODSD0：能在参参考培养养基上生生长至少少10个个菌落的的最高稀稀释度DS：能在测测试培养养基上显显示生长长的最高高稀释度度非目标菌菌在选择择性培养养基上的的SF至少为2半定量和和定量法法中，非非目标菌菌应部分分或全部部被抑制制培养基测测试方法法定量测试试方法半定量测测试方法法定性测试试方法几种方法法的使用用原则通常使用用半定量量或定性性测试方方法就能能满足实实验室对对培养基基性能测测试的要要求评价新的的培养基基或新的的供

10、应商商的产品品时，应应采用定定量测试试方法采用定量量方法时时，必须须使用参参考培养养基进行行对照；采用半半定量和和定性方方法时，使用参参考有助助于结果果解释。参考培养养基必须须是从近近期批次次中选出出的已知知质量良良好的培培养基。介绍几种种常用的的质控方方法Miles-Misra法(定量方法法)改进的平平板划线线法(半定量方方法)平板接种种观察法法(定性方法法)上述均为为固体培培养基测测试方法法,液体培养养基定量量和半定定量测试试方法也也要通过过固体培培养基菌菌落计数数技术才才能得到到结果。改良Miles-Misra法操作方法法测试菌株株过夜培培养物10倍稀释测试平板板和参照照平板划划分为4个

11、区域并并标记从最高稀稀释度开开始，分别滴滴一滴稀稀释液于于试验平平板和对对照平板板标记好好的区域域将稀释液液涂满整整个1/4区域，37C培养18hr。对易计数数的区域域计数，按公式式计算结结果方法举例例测试培养养基在10-5稀释度上上有30个菌落参照培养基在10-5稀释度上上有40个菌落通过公式式计算：PR= 10-530/10-540=0.75注：在几几种固体体计数方方法中，Miles-misra方法和螺螺旋平板板涂布法法效果较较好。改进的划划线法接接种法模模式图计算算计算生长长指数G：每条有菌菌落生长长的划线线记作1分，每个个仅一半的的线有菌菌落生长长记作0.5分没有菌落落生长或或生长量量

12、少于划划线的一一半，则则记作0如：菌落落在A区和B区全部生生长，而而在C区有一半半线生长长则G为10目标菌在在培养基基上应呈呈现典型型的生长长，而非非目标菌菌的生长长应部分分或完全全被抑制制目标菌的的生长指指标G大于6时时，培养养基可接接受结果解释释定性测试试方法用3mm接种环取取测试菌菌培养物物，在测测试培养养基表面面划平行行直线。可同时时在一个个平板上上接种多多个菌株株，但划划线不能能交叉按标准中中规定的的培养时时间和温温度对接接种后的的平板进进行培养养结果解释释培养后按按以下方方法计分分：0表示无无生长1表示微微弱生长长2表示生生长良好好目标菌得得分应为为2，并有典典型的菌菌落外观观、大

13、小小和形态态非目标菌菌的生长长应部分分或全部部被抑制制质控菌株株要求标准菌株株：来自自国际/国家菌菌种保藏藏中心(本标准准要求为为ATCC菌株株)或经经ISO9002认证证的经销销商提供供的菌株株(有资资质)制备储备备菌株和和工作菌菌株时一一次制备备多份，每株菌菌原则上上不能重重复使用用通常工作作菌株不不能再传传代，但但处理得得当可再再次使用用标准储备备菌株(Referencestock)标准菌株株在实验验室经过过一次传传代获得得的一组组完全相相同的菌菌株传代菌株株应当完完全具备备标准菌菌株的所所有性状状传代时要要保证一一定的量量(减少传代代次数)每株菌株株尽量避避免多次次使用采用不同同的保存

14、存方法保保存期限限不同如冻干法法,液氮法,穿刺法,液体石蜡蜡法,斜面保存存法等(见后)菌种保藏藏方法液氮保存存法低温保存存法液体石蜡蜡保存法法液氮保存存法保存制备细胞胞悬液，甘油或或二甲亚亚砜作保保护剂分装无菌菌安瓿瓶瓶，每管管0.2ml预冻至-40（控制制温度下下降速率率为1min）放入液氮氮生物贮贮存罐中中气相保保存恢复直接浸入入38水浴中中解冻510min转接于适适宜培养养基内培培养注意：大大多数属属种适于于慢速冻冻结和快快速解冻冻适用菌种种病毒支原体各类细菌菌、放线线菌、酵酵母菌、丝状真真菌蓝藻动物细胞胞液体石蜡蜡覆盖保保存法传代保存存的变相相方法能够适当当地延长长保存时时间优质石蜡蜡121高压灭灭菌2小时，160干燥箱箱中灭菌菌12小时，放放冷备用用液体石蜡蜡的深度度以1cm左右保存期通通常6个个月至一一年适用菌种种霉菌、酵酵母菌、放线菌菌、部分分细菌。如：大大肠杆菌菌、变形形杆菌、金黄色色葡萄球球菌等需需氧性细细菌不能用于于低温冷冷冻保存存的微生生物（如如孢子形形成能力力极差的的丝状菌菌）不适于用用菌种：固氮菌菌、乳酸酸杆菌、明串珠珠菌、分分枝杆菌菌、沙门门氏菌，丝状菌菌中的毛毛霉、根根霉菌等等甘油低温温保藏法法保藏方法法：菌种悬浮浮在10(体积分数数)甘油蒸馏馏水中。置于低低温(-70)保藏。注意事项项：所要保藏藏的菌种种，最好好先培养养至对数数