实验十二金黄色葡萄球菌

1、二、实验原理金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属，可产生肠毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食品中毒，因此，由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒。第一页，共四十一页。生化特性典型的金葡菌呈球形，大小0.51.0m。致病性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长，常呈双球菌或短链状排列。本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰氏染色阳性。金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为5%7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制杂菌。第二页，共四十一页。可产生溶血素，在血平板生生长菌落周围有透明溶血环。可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱。致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。第三页，共四十一页。金葡菌

2、镜下特征第四页，共四十一页。操作流程检样25g(mL) +稀释液225mL，均质血浆凝固酶试验7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）BHI肉汤和营养琼脂斜面Baird-Parker平板，血平板涂片染色361 ， 18h24h结果报告361 B-P平板18h24h或45h48h观察溶血血平板 18h24h第五页，共四十一页。菌落特征Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径2mm3mm。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。BP培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌繁殖，并能促进

3、金葡生长产生黑色和晕圈。丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金葡生长第六页，共四十一页。Baird-Parker平板第七页，共四十一页。典型菌落特征：黑色, 有光泽, 突起菌落并伴有透明圈，通常外层有清晰圈第八页，共四十一页。血平板：菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。第九页，共四十一页。血平板第十页，共四十一页。血浆凝固酶试验吸取新鲜兔血浆(冻干血浆配制)0.5mL于小试管中, 加入培养24 h 的金黄色葡萄球菌BHI肉汤培养物0.20.3mL, 震荡摇匀, 置36温箱或水浴内, 每半小时观察一次,观察6小时,如呈现凝块 ,凝固体积大于原体积的一半,为阳性结

4、果. 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及BHI肉汤作为对照. 结果可疑:挑取营养琼脂斜面的菌落到5mlBHI 36 培养1848h第十一页，共四十一页。第十二页，共四十一页。形态符合，血浆凝固酶阳性的为金黄色葡萄球菌结果报告：未检出/25g(mL)第十三页，共四十一页。三、实验器材2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱、冰箱、 恒温水浴箱、 天平、 均质器、 振荡器、无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头、 无菌锥形瓶：容量 100 mL、500 mL、 无菌培养皿、 注射器：0.5

5、mL、 pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。 第十四页，共四十一页。3 培养基和试剂 3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录 A中 A.1。 3.2 7.5 %氯化钠肉汤：见附录 A中 A.2。 3.3 血琼脂平板：见附录 A中 A.3。 3.4 Baird-Parker琼脂平板：见附录 A中 A.4。 3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录 A中 A.5。 3.6 兔血浆：见附录 A中 A.6。 3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.7。 3.8 营养琼脂小斜面：见附录 A中 A.8。 3.9 革兰氏染色液：见附录 A中 A.9。 3.10 无菌生理盐水：见附录 A中

6、A.10。 第十五页，共四十一页。四、实验内容及操作金黄色葡萄球菌定性检验程序见图 第十六页，共四十一页。第十七页，共四十一页。5.1 样品的处理称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当

7、数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 第十八页，共四十一页。5.2 增菌和分离培养将上述样品匀液于 36 1 培养 18 h24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 将上述培养物， 分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板， 血平板 36 1 培养 18 h24 h。Baird-Parker平板 36 1 培养 18 h24 h 或45 h48 h。 第十九页，共四十一页。金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明

8、圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 第二十页，共四十一页。5.3 鉴定染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 m1 m。 血浆凝固酶试验： 挑取、 Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上， 分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，3

9、6 1 培养18 h24 h。 第二十一页，共四十一页。取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培养 18 h48 h，重复试验。 第二十二页，共四十一页。第二十三页，共四十一页。金黄色葡萄球菌计

10、数第二法 BP平板计数(AOAC ISO) 金葡含量较高的食品第三法 MPN计数 金葡含量较低而杂菌含量较高 第二十四页，共四十一页。BP平板计数方法 样品稀释及样品接种根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块BairdParker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。 BairdParker平板表面有水珠，可放在2550的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。第二十五页，共四十一页。BP平板计数方法培养涂布后，将平板静置10分钟，如样液不易吸收，可

11、将平板放在361孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿，倒置于培养箱，361培养，45 h48 h。第二十六页，共四十一页。典型菌落计数和确认金黄色葡萄球菌在BairdParker平板上，菌落直径为2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。第二十七页，共四十一页。典型菌落计数和确认选择菌落数在20 cfu200 cfu之间平板上的典型菌落计数 最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数

12、该稀释度平板上的典型菌落 某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上一倍稀释度平板上没有典型菌落，计数该级稀释度平板上的典型菌落；第二十八页，共四十一页。典型菌落计数和确认某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，且上一倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20 cfu200 cfu之间，计数该级稀释度平板上的典型菌落；以上按公式一计算。平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间，按公式二计算。从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，361培养1824h。第二十九页，共四十一页。典型菌落计数和确认公式一：T=AB/

13、CdT-样品中金黄色葡萄球菌落数A 某一稀释度典型菌落的总数B 某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数d 某一稀释度C 某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数第三十页，共四十一页。样品稀释度 10-110-2典型菌落数66，646，6用于做血浆凝固酶的菌落数55血浆凝固酶阳性菌落数44第三十一页，共四十一页。T=AB/CdT=65450.1=520第三十二页，共四十一页。典型菌落计数和确认公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dN样品中金黄色葡萄球菌落数 A1-第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落总数A2-第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落总数B1-第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数

14、B2-第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数 第三十三页，共四十一页。C1-第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数C2-第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数d 稀释因子（第一稀释度）1.1计算系数第三十四页，共四十一页。样品稀释度 10-110-2典型菌落数150，16018，16用于做血浆凝固酶的菌落数55血浆凝固酶阳性菌落数34第三十五页，共四十一页。公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dA1B1/C1=15535=93A2B2/C2=1745=14T=(93+14)/1.1d=1271.10.1=970第三十六页，共四十一页。结果报告单位:cfu/g或cfu/mL 如T值为0，报告 1 d cfu/mL（g）。第三十七页，共四十一页。检样检样25g(mL)+ 225ml灭菌生理盐水，均质。10倍系列稀释选择3个连续的适宜浓度的样品匀液，接种BP平板计数及血浆凝固酶试验报告 361 1824h 第三十八页，共四十一页。金黄色葡萄球菌MPN计数样品稀释 接种和培养根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度 的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%NaCl 胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物361培养，45h48h。 用3mm接种环，从有