高效液相色谱法讲解课件

1、第二章高效液相色谱法一、高效液相色谱法 的特点二、流程及主要部件三、影响分离的因素四、高效液相色谱法 的主要分离类型2022/10/16第二章高效液相色谱法一、高效液相色谱法2022/10/11液相色谱仪（1）2022/10/16液相色谱仪（1）2022/10/11液相色谱仪（2）2022/10/16液相色谱仪（2）2022/10/11液相色谱仪（3）2022/10/16液相色谱仪（3）2022/10/11液相色谱仪（4）2022/10/16液相色谱仪（4）2022/10/11液相色谱仪（5）2022/10/16液相色谱仪（5）2022/10/11一、高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高

2、速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。2022/10/16一、高效液相色谱法的特点 特点：高压、高效、高速201高效液相色谱法与气相色谱法比较（1）应用范围不同 气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。据统计只有大约20%的有机物能用气相色谱分析；而液相色谱适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 80%。（2）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质在液相中的传质速率慢，而在气相色谱中气体的传质速率要快得多。2022/10/161高效液相色谱法与气相色谱法比较（1）应用范围不同2022（3）液相色谱能

3、完成难度较高的分离工作 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。 液相色谱固定相类型多，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于色谱分离条件的选择，而气相色谱一般都在较高温度下进行的。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易，而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。2022/10/16（3）液相色谱能完成难度较高的分离工作 气相色谱的流 2高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优

4、点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。 例如对氨基酸分离，用经典色谱法需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 又如用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分. 2022/10/16 2高效液相色谱法与经典液相色谱法比较 高效液小结 综上所述，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱的优点，具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范围广等优点。 目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色

5、素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。2022/10/16小结 综上所述，高效液相色谱法是吸取了气相二、流程及主要部件1.流程高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统2022/10/16二、流程及主要部件1.流程高压输液系统 进样系统 Agilent 1100 LC的主要部件2022/10/16Agilent 1100 LC的主要部件2022/10/112.主要部件(1) 高压输液系统主要部件之一，包括贮液装置、高压输液泵、过滤器、脱气装置等 高压输液泵压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很

6、小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。基本要求： 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳 定可调、耐腐蚀等特性2022/10/162.主要部件(1) 高压输液系统2022/10/11(2) 梯度淋洗装置外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2022/10/16(2) 梯度淋洗装置外梯度: 内梯度:2022/1(3) 进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，也可

7、配备自动进样装置。 其结构如图所示：2022/10/16(3) 进样装置 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高(4) 高效分离系统色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2022/10/16(4) 高效分离系统色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。(5) 高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（UVD）：最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。 最常用的检测器。2022/10/16(5) 高效液相色谱检测器 紫外光度检测器（UVD）光电二极管阵列检测器

8、 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2022/10/16光电二极管阵列检测器 光电二极管阵列检测器：1（6） 数据处理系统 色谱工作站的功能：色谱参数的选择和设定；自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。同时也可把一些常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。 2022/10/16（6） 数据处理系统 色谱工作站的功能：2022/10/12022/10/162022/10/111. 固定相及分离柱 气相色谱

9、中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领域。三、影响分离的因素2022/10/161. 固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上2. 流动相及流动相的极性 （1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3）若淋洗液的极

10、性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2022/10/162. 流动相及流动相的极性 （1）可显著改变组分分离流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分； 按极性可分为极性、弱极性、非极性； 按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂: 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2022/10/16流动相组成 流动相按组成不同可分为单组分和多组分；2选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量

11、杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2022/10/16选择流动相时应注意的几个问题：（1）尽量使用高纯度试剂作流动四、 高效液相色谱法的主要分离类型1. 吸附色谱（液-固吸附色谱） “液-固色谱法”是利用各组分在固定相上吸附能力的不同而将它们分离的方法。以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。流动相可以是各种

12、不同极性的一元或多元溶剂。2. 分配色谱（液-液分配色谱） 早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, 现多为化学键合固定相，即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面。2022/10/16四、 高效液相色谱法的主要分离类型1. 吸附色谱（液-固吸3. 离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离。 可分离分析：核苷酸、碳水化合物、有机酸、蛋白质、酶等 4. 凝胶色谱（空间排阻色谱） 按分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法。以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的

13、通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。2022/10/163. 离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流五、高效液相色谱法的应用1. 在食品分析中的应用1)食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类等；2)食品添加剂分析：防腐剂、着色剂等；3)食品污染物分析：霉菌毒素等。 2. 在环境分析中的应用 多环芳烃（特别是稠环芳烃）、农药残留等。2022/10/16五、高效液相色谱法的应用1. 在食品分析中的应用2022/1五、高效液相色谱法的应用 3. 在生命科学中的应用 1) 低分子量物质，如氨基酸、糖类、维生素等的分离和测定。2) 高分子量物质，如蛋白质和酶的纯化、分离和测定。 4. 在医学检验中的应用1）合成药物：抗生素、抗忧郁药物等。2）天然药物生物碱（鸦片碱）等5在无机