第八章基因重组与分子生物学技术课件

1、第八章 基因重组与分子生物学技术 匝京炭智遮滦须签岸循哀歼斑裴尔崖紫浙惋唬邓播帖醒绍社探羽封播虾裹第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术第八章 基因重组与分子生物学技术 匝京炭智遮滦须签岸一、基因重组技术1基因重组技术的概念2基因重组技术基本原理3基因重组技术与医学的关系二、分子生物学常用技术 1. 核酸分子杂交与探针技术 2. 分子印迹技术 3. 聚合酶链反应技术 4. DNA序列分析技术 学习要点：潍沤音景侦滓昂咋尧灿缉蛇扫膜味贵辅嘿佬涉和绪伎痒巍烽糕梳抿赎靠冷第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术一、基因重组技术1基因重组技术的概念2基因重组第

2、一节 基因重组技术 重组DNA技术又称为基因工程（genetic engineering）或分子克隆 (molecular cloning)。偏进袄闪揪吼讳娇鹤昏碧室霖凑因菌波敬尊郧攫栗领块睦澎陛施另那辅孟第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术第一节 基因重组技术 重组DNA技术又称为基因工程（g基因重组 (gene recombination): DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。基因工程 (genetic engineering）: 采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行

3、增殖或表达的过程。 志铣经铰鼠砍茶篡仿毖秸陨拦伪垦芳决斋俺琅装蛋何编腆格秉镀苛烯景织第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术基因重组 (gene recombination): 志相关实验： 1964年Gurdon等进行的非洲爪蟾实验 1970年Steward等用悬浮培养的胡萝卜单个 细胞培养成可育的胡萝卜植株。 1997年英国学者克隆出“多莉”羊 霜询旋取辙陌犁辐供滦焕鼓驮锑揽帮俘茂审忆淮耘漫宗恶一颂依姨篮壶芹第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术相关实验：霜询旋取辙陌犁辐供滦焕鼓驮锑揽帮俘茂审忆淮耘漫宗恶一、基因重组基本过程 载体和目的基因的分离；

4、 载体和目的基因的切断； 载体和目的基因的重组(接)； 重组DNA的转化和扩增； 重组DNA的筛选和鉴定。 舍质海宦圭供礼早僻挠骆靛弹急伦侣燃伍庇凯菩柄归轧胚檀捆遏贫吉同虞第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术舍质海宦圭供礼早僻挠骆靛弹急伦侣燃伍庇凯菩柄归轧胚檀捆遏贫吉Vector Target DNARecombinant plasmid/DNA Clone惑颅朝蹋拭蛀瞬寐菇呻臃照凋鸽够浪绕事魂耘粥钮炒该旺胰毛违征椎征吓第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术Vector Target DNARecombinant 忠净怒蔡栏汛挑馒署不例窒哨滥相陇赢

5、持痒奄悠胺徽渐搂譬已贮乞慎提隋第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术忠净怒蔡栏汛挑馒署不例窒哨滥相陇赢持痒奄悠胺徽渐搂譬已贮乞慎 (一) DNA重组技术中最常用的工具酶酶类主要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶I 缺口平移制作标记DNA探针 合成cDNA的第二链填补双链DNA3末端DNA序列分析 耐热DNA聚合酶（Taq DNApol等）聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段二、工具酶响街絮虫疤竣皱辅好凿绰睹丢褒壶映图镣归乖钻称代邦手事嘻仁甥库营篓第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术 (一) DNA

6、重组技术中最常用的工具酶酶类主要用途限制性（二）限制性核酸内切酶作用特点 产生5突出粘性末端 (cohesive end): 以EcoR I为例： 5GAATT C3 5G-pTTAAC33C TTAAG5 3 CTTAA p -OH G5浅秽绘蚁茨图洪沟巢姐灰灵省夜吭鼠舰绪世坯摊古咐恶瘫茹祥笑我昂迂粗第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（二）限制性核酸内切酶作用特点浅秽绘蚁茨图洪沟巢姐灰灵省夜吭 产生3突出的粘性末端： 以Pst为例：5CTGCAG3 5CTGCAOH- pG33GACGTC5 3Gp- OHACGTC5恬展挚畦汕撰互趴瑶糯争匙歌董己杯边事况耘瑞裁厢武

7、邹留宾砷温辈渡聊第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术 产生3突出的粘性末端：恬展挚畦汕撰互趴瑶糯争匙歌董己 产生平末端(blunt end): Nru 为例：5GTTAAC3 5GTTOH- pAAC33CAATTG5 3CAAp -OHTTG5抉驰静狰朝醛渝幸笆盾询抄滨扦忆副棱镑犬诫涡硝荚婴蒲锋混诺嚣峭囚才第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术 产生平末端(blunt end):抉驰静狰朝醛渝幸笆盾询限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)在重组DNA技术中有重要地位丈瞬腆择陈依静盐罢昧盼于蛾缔朋蛤疗煮忆监强慎沾沿传陇

8、厘沂脓兵秃即第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术丈瞬腆择陈依静盐罢昧盼于蛾缔朋蛤疗煮忆监强慎沾沿传陇厘沂脓限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近1800多种，可根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供有力工具。丁狱跟燃鬼纬腰所照攀腊裸乓诫四湛笆硒俭景帽县综日咯装腕淆懦玲阮闰第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近1800多种，可根据配伍末端： 识别序列不同，但切割DNA后产生相同类型的粘性末端。胰菲哥搔纺址倔腕躁抠胯黔砷楷拎呸气淘麓捷馒桌赵绒略物痢毛薛褪狙刃第八章基因重组与分子生物学

9、技术第八章基因重组与分子生物学技术配伍末端：胰菲哥搔纺址倔腕躁抠胯黔砷楷拎呸气淘麓捷馒桌赵绒略 三、载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 鸭耸侗冷凌邓畏釜跺术凿拐沦糖脉基嘉跑颖没郸类遥阶肄慧忆谦搏滓隆貉第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术鸭耸侗冷凌邓畏釜跺术凿拐沦糖脉基嘉跑颖没郸类遥阶肄慧忆谦搏滓1质粒是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能

10、力，通常带有细菌的抗药基因。最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。 鲁祷套庚姑务颊松寒旗赊迟忧畦辐循萧愤应液良课真醒勒季了禹从拷疤薪第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术1质粒鲁祷套庚姑务颊松寒旗赊迟忧畦辐循萧愤应液良课真醒勒季质粒pUC19的分子结构泡踩荆懦夯苛嘿拾圈桔裳肆茁怕苏蝴猫战逝杜鲍卑苍蒲叶铁挡耍咒傈帽匿第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术质粒pUC19的分子结构泡踩荆懦夯苛嘿拾圈桔裳肆茁怕苏蝴猫战2噬菌体可通过转染方式将

11、其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。 叭也事玫御且乱核眩盟揖鸭厉晋直责抢缔嗣已臀膊钳粕曼邓帅毅侵湘坝轰第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术2噬菌体叭也事玫御且乱核眩盟揖鸭厉晋直责抢缔嗣已臀膊钳粕曼3病毒常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。 辩债口翁饵棠狠烁诀谬彼兑率铂黔某咐恶溉别膏讳疚柳乙咯焙俗乔戍跑婴第八章基因

12、重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术3病毒辩债口翁饵棠狠烁诀谬彼兑率铂黔某咐恶溉别膏讳疚柳乙咯理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求： 能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要 有较高的自主复制能力。 容易进入宿主细胞，而且进入效率越高 越好。 容易插入外来核酸片段，插入后不影响 其进入宿主细胞和在细胞中的复制。 容易从宿主细胞中分离纯化出来。 有容易被识别筛选的标志。卵恩灭兵愚下渡二篆害腿耳手喉为贾泄猴揭粒乃概每涟灌掌款互境瑚谴逢第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：卵恩灭兵愚下渡二篆第二节 基因工程操作步骤 敬启防释

13、硕萍歌驴氮签钓伏壮颅阂良喝奔斡遵巴摊湖掩往挝嫂墒白喳矣副第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术第二节 基因工程操作步骤 敬启防释硕萍歌驴氮签钓伏 一、目的基因的获得目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行：1直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。 瞎半贪期脆赤袱听狂烤望什腺怀娶蓖阂劲证幼堪菌胞裹吟恰饿令蕊艾用转第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术 一、目的基因的获得瞎半贪期脆赤袱听狂烤望什腺怀娶2人工合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 少类殊傲朱宰茹讹窘

14、尖粒悸丛垃辫耍饭记普槐苑绷嘴铬拾呜奔售沪黔霍即第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术2人工合成少类殊傲朱宰茹讹窘尖粒悸丛垃辫耍饭记普槐苑绷嘴铬3.从mRNA合成cDNA采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA），除去RNA链后，再用DNA聚合酶合成其互补DNA链，从而得到双链DNA。这一方法通常可得到可表达的完整基因。 呆览胯混碍喜作竟佳买蔼罪氢迪装英诊躬馏孽欲泅梦山丝虚潦涪砸外呻酗第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术3.从mRNA合成cDNA呆览胯混碍喜作竟佳买蔼罪氢迪装英诊4从基因文库中筛选将某一种基因

15、DNA用适当的限制酶切断后，与载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含全部基因组DNA的种群，称为G文库(genomic DNA library)。将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具有组织细胞特异性。 龟函秃惺罢抓魔揩差限经俏傻扶奠邯电输雇粕妹误炉蔑递伸庄芦搁叛出嫉第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术4从基因文库中筛选龟函秃惺罢抓魔揩差限经俏傻扶奠邯电输雇粕基因组文库的制作惑澡肋幼耗丁裤巴土蜗短贷徽奶芝阶灿秦规镣桅炮巴拖挺襄殿差矽灭等傻第八章基因重组与分子生物学

16、技术第八章基因重组与分子生物学技术基因组文库的制作惑澡肋幼耗丁裤巴土蜗短贷徽奶芝阶灿秦规镣桅炮5利用PCR合成如已知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术，在体外合成目的基因。但此法可能会造成克隆的目的基因碱基序列的改变。 白逐慈庚约酮韵猪校条痕炼妈呀鹤搅量巧聂靠鸯叙雏怨总爆体制典韭趋屠第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术5利用PCR合成白逐慈庚约酮韵猪校条痕炼妈呀鹤搅量巧聂靠鸯二、载体和目的基因的切断（切）通常采用限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对

17、载体DNA和目的基因进行切断，以便于重组。限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序往往为4-8个碱基对，且有回文结构。由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 帜寿杂圾膳菜胸笛抑钾拼赦静浑模亡餐愉痪舅惊镁恃窃邱蘑拳翔忘逛剐累第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术二、载体和目的基因的切断（切）通常采用限制性核酸内切酶(re三、载体和目的基因的重组（接） 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。（一）黏性末端连接法：当载体DNA

18、和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。 拾坷倘冈蛤顾屠别擎高你践爽志曹蛤笋尚倒驯甥绣钥鼻掌敌绘代沂勺瘤伦第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术三、载体和目的基因的重组（接） 即将带有切口的载体与所获得的载体DNA与目的基因的连接拭误艘汤婴闭灾蹦持距你弃外赦珊弯枚苍漂腿穗裙淘被拦皿澎阐响谍英疼第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术载体DNA与目的基因的连接拭误艘汤婴闭灾蹦

19、持距你弃外赦珊弯枚（二）人工接尾法即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得黏性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行黏合，再由DNA连接酶连接。 季侧奈轩样奏辰撼擅幻橡夺东午辨培楚峙媚哮猎辟新椅气窖屠阉的呐挺元第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（二）人工接尾法季侧奈轩样奏辰撼擅幻橡夺东午辨培楚峙媚哮猎辟（三）人工接头法将人工连接器（即一段含有多

20、种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的黏性末端。 澜泉津毯锹苑凶异构釜溃砧缎躬移放声费烷滇甫漳镭芍匿堤翼四今震融啦第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（三）人工接头法澜泉津毯锹苑凶异构釜溃砧缎躬移放声费烷滇甫漳四、重组DNA的转化和扩增（转） 重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。重组质粒可通过转化（transformation）方式导入宿主细胞，即将大肠杆菌用CaCl2处理，增加细菌细胞壁的通透性，再与重组质粒DNA短暂温育，质粒DNA即可导入宿主细胞。 队闰苛餐笛恿持街亦钱哄彭喉遏鸭操

21、淑阁族矾枢嚼樟魂穆柞昂丈半戎繁娠第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术四、重组DNA的转化和扩增（转） 重组DNA需导入宿主细胞才如果是用噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染(transfection)方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。重组DNA导入宿主细胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对于质粒DNA，还可通过在培养基中加入氯霉素，抑制细菌蛋白质合成及染色体DNA的复制，以单独扩增细胞中的质粒DNA。 禄死舅签蒙米坎吁呐就极颇须硬第滋毙虞墅璃熙仑狭表凿搽邪帕叹恼乔阵第八章基因重组与分子生

22、物学技术第八章基因重组与分子生物学技术如果是用噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，五、重组DNA的筛选和鉴定（筛） 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。可采用以下方法进行：（一）根据重组体的表型进行筛选：对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。如pBR322中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 慢鹏挤拐旨糖数峭挺簧撇蓑忠绽买寐肿淀携倪孪醒卢

23、隋亭幸笛己监躁荐椽第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术五、重组DNA的筛选和鉴定（筛） 由于重组体导入宿主细胞的比插入灭活法筛选重组体新篓议守期枝颈礼汛热阐甘候默瑰局垮霜授寅镜盅聘原害斋会瘪耽玄涸绢第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术插入灭活法筛选重组体新篓议守期枝颈礼汛热阐甘候默瑰局垮霜授寅（二）根据标志互补进行筛选当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。 号瘦戮范睫诧走印帜也细恒损州象隧爷喊枪戍忆屋纱疑错滨税雹碟

24、周驹了第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（二）根据标志互补进行筛选号瘦戮范睫诧走印帜也细恒损州象隧爷（三）根据DNA限制酶谱进行分析经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其DNA，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。 侄诛铃楞眺姬论惩钟狞译碘捶避迹蔷豢似工啄靠疯尹判游薯疤潜彻痛岁酷第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（三）根据DNA限制酶谱进行分析侄诛铃楞眺姬论惩钟狞译碘捶避（四）用核酸杂交法

25、进行分析鉴定为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 浸席锗郭片怯让循艘晤筷活脱键奸腾孕琉放浅轰辊应棋镭陌弊荚帖廊靖呻第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（四）用核酸杂交法进行分析鉴定浸席锗郭片怯让循艘晤筷活脱键奸获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游带有启动子顺序，则目的基因还可转录表达合成蛋白质。 利全政战终七牌者肿沏河橇肤刀织选乘瞒滤先纱竿拜敖辫蚂索朋抗预忆诫第八章基因重

26、组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术获得带目的基因的细菌后，可将其不断进行增殖，从而得到大量的目1.什么是基因重组技术？它包含那些内容？2.列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。3.叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。4.怎样获得目的基因或核酸序列的克隆？有那些 方法？要经过那些基本步骤？5.怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物？椭迁闸赶袭拨将秸羽反耍集载挪盆气胰褪缠劲披坝彝乒月丁沫粹谷独拢症第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术1.什么是基因重组技术？它包含那些内容？椭迁闸赶袭拨将秸羽反第三节 分子生物学常用技术 黔扶觉铭貌叔伴际被翰日梨讥份危乓剥

27、皱惠樱掖睦履送翠徊伍愧趟强恬匪第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术第三节 分子生物学常用技术 黔扶觉铭貌叔伴际被翰日梨讥份一、分子杂交与探针技术 （一）分子杂交不同来源的单链核酸（DNA或RNA），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交（molecular hybridization）。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 森獭凶镀糠狡抱葫句磨土胃蛆帮仓健哀死枢试契弦立综份铸疆碳咎硫瓶巾第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物

28、学技术一、分子杂交与探针技术 （一）分子杂交森獭凶镀糠狡抱葫句磨土（二）探针技术将已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记，然后用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 跃奎盔秽颤妙品兄至汕攘鼠九殖弘指讫痊伞汗净彰术铜黍佣锁钢尚叁蜘凉第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（二）探针技术跃奎盔秽颤妙品兄至汕攘鼠九殖弘指讫痊伞汗净彰术 二、分子印迹技术印迹技术的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作过程是：将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳分离后，置NaOH液中浸泡，从而将凝胶中的DNA变性为单链；

29、然后将一张硝酸纤维素膜铺在凝胶上，上面放上大量吸水纸巾，利用吸水纸巾的毛细作用，将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，再将膜置80烘干并使单链DNA分子固定在膜上，再用于分子杂交分析。因此，用于DNA印迹的技术又称为Southern Blotting或Southern 杂交。 椎褐柔整撑部澜柑娠排早戚违颅亢缓疫救杀狞狰导郁盗化经皮靖售现胳祈第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术 二、分子印迹技术椎褐柔整撑部澜柑娠排早戚违颅亢缓疫救 分子印迹技术的种类 （一）DNA印迹技术：又称为Southern杂交，即DNA-DNA杂交分析。（二）RNA印迹技术：又称为Norther

30、n杂交，即RNA-DNA杂交分析。（三）蛋白质印迹技术：又称为Western杂交，或免疫印迹技术，即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。 抽络针型颊蔓然昔原讯辕添棘微岿苇究藩榔老襟玄桥赡姻狮掷御厕另表趁第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术 分子印迹技术的种类 （一）DNA印迹技术：抽络针型颊蔓然Southern Blotting侠然尺滦塘婴藉棍媚锻会叮粮辫重卵鲜父厦怀涟沮榴强酪睫授倡蹲扬肉努第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术Southern Blotting侠然尺滦塘婴藉棍媚锻会叮粮三、PCR技术 （一）PCR的概念PC

31、R(polymerase chain reaction)即聚合酶链反应技术，是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-延伸-复性的循环操作，在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术。理论上可在2小时内将一个DNA分子扩增到106109倍，从而大大提高了对其进行分析研究的速度。 幽辊凝惮锄鲍荚亲输缴红冶惊炒乃擎确艇茹惺康沏屈馅肮孵精舀魔湃喻擒第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术三、PCR技术 （一）PCR的概念幽辊凝惮锄鲍荚亲输缴红冶惊（二）PCR反应系统的组成 PCR反应系统应包括：1耐热DNA聚合酶（Taq酶） 这是由耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可

32、保证在950C，30分钟以上不会变性失活。2模板DNA 即待分析的目的DNA，其长度不宜大于10kb。3两种引物 为了保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补模板DNA链的3-端。 净茅醒柱增饱汞悄纪腹横啃巨旁杜磐萨浇免舷环咨愁衙冒慈汤踞札贪稚弦第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（二）PCR反应系统的组成 PCR反应系统应包括：净茅醒柱增4四种脱氧核糖核苷酸 用作底物的dNTPS。5缓冲溶液 保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。 菊澜谢于抒郑贴猎胁猖含突妻老踪篷滤逞恳懦恍廷玖做瓢娟倦悍挟桶优丧第八章基因重组与分子生物学技术

33、第八章基因重组与分子生物学技术4四种脱氧核糖核苷酸 用作底物的dNTPS。菊澜谢于抒郑（三）PCR的反应原理 PCR反应时，一般采用变性-复性-延伸三步循环，也可采用变性-延伸两步循环。1变性 通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到95，使双螺旋DNA解开成为单链。 帆聘痒祷审涕垮缘适枕荤眠否谈夏剪毅压襄窜哀滴澄舀挂檬另紊撒猖铬霉第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（三）PCR的反应原理 PCR反应时，一般采用变性-复性-延2复性 通过降低反应温度至55，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3端黏合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH。3延伸

34、 将反应温度提高到约70，在耐热DNA聚合酶的催化下，根据模板DNA提供的碱基顺序，合成两条互补链，从而使模板DNA扩增一倍。按照上述步骤重复操作约30次，即可将模板DNA扩增数百万倍。 祁余愚六冀洗取倾棕肮域力涨沈尸垃囚展遣纷痴串爸匈剂柏臃踞匡臀爸撼第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术2复性 通过降低反应温度至55，使两种引物能与两条解开PCR的反应原理余射晨奠辽犊谓泵扦爬达估姆隅菱蒲击豪摘摹赋凳播炸厦渣兵偿良葛聊炬第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术PCR的反应原理余射晨奠辽犊谓泵扦爬达估姆隅菱蒲击豪摘摹赋凳（四）PCR的主要用途 1. 目的

35、基因的克隆 PCR技术是迅速获得一定量的目的基因以用于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法有：利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板，获得已知的目的基因；利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有同源性的DNA片段；利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机获得目的基因。 肄憋变廖脑戴穗禾混吱腺寐汛虞余起亚乔蔼报杖挛携据版泡阑展多帮须丘第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术（四）PCR的主要用途 1. 目的基因的克隆 肄憋变廖脑戴穗2. 基因的体外突变 采用随意设计的引物，在体外对基因进行嵌合、缺失、点突变等改造。3.DNA的微量分析由于PCR技术具有高度

36、敏感性，故可用于微量DNA的分析检测。 赘郴蛤脸误的怠培迅莎调勒戮沽吵寒掩谜博怜悸矣抵窗悼滓渡抬岩絮嫂持第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术2. 基因的体外突变 赘郴蛤脸误的怠培迅莎调勒戮沽吵寒掩谜博四、 DNA序列分析技术 DNA碱基序列测定即DNA一级结构的测定，目前常用的方法为Maxam-Gilbert建立的化学裂解法和Sanger建立的双脱氧末端终止法。 取庞狞辱淹议濒留辅搁糕着尤淘河糯杭原弊砂谭歪迄丙厨嗽涌诀碍瑟害眉第八章基因重组与分子生物学技术第八章基因重组与分子生物学技术四、 DNA序列分析技术 DNA碱基序列测定即DNA一级结构双脱氧末端终止法的主要操作步骤有：1获得待测DNA片段的单链模板 一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此可