生物分离工程第二章课件

1、第二章 细胞分离与破碎1总体学习目的和要求 通过本章学习，要求掌握细胞分离和目标产物释放的原理和方法，熟知各种方法的优缺点和应用范围。 2收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。固液分离的目的32.1 细胞分离 重力沉降 离心沉降 过滤 4重力沉降 重力沉降是化工过程中常用的气固、液固和液液分离手段，在生化分离过程中亦有一定程度的应用。5 菌体和动植物细胞的重力沉降虽然简便易行，但菌体细胞体积很小，沉降速度很慢。因此，实用上需使菌体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行沉降操作，提高沉降速度。 7提高重力

2、沉降的途径加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团引入外力8应用1878年 瑞典 牛奶奶油1896年 用于回收酵母离心分离技术在生工方面主要用于：分离DNA、大分子、菌体、动植物细胞、胞内产物。10离心沉降速度 离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量离心程度的参数，用Z表示 式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距离，N为离心机的转数(s-1) 。11离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因此，将式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs为 或12提高离心沉降速度的主要措施d 颗粒直径； S 固体颗粒密

3、度；L 液体介质密度； L 液体介质粘度； 旋转角速度； r 转轴中心到颗粒中心距离 增大dp增大S提高离心机转数N提高离心半径r降低液体粘度14离心分离法差速离心区带离心 15 差速离心1718主要菌体和细胞的离心分离19区带离心 区带离心(Zonal centrifugation)是生化研究中的重要分离手段，根据离心操作条件不同，分为差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation)平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation) 20 梯度 离心2122密度梯度离心（density gradi

4、ent） 生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。滴加样品蔗糖浓度离心管蔗糖密度梯度24密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用1、核酸密度的测定 = o + 4.2 2(2- 02)10-102、测定DNA中G-C之含量 Rolfe-Meselson公式： = 0.100 xG-C + 1.6583、溶液中核酸构象的研究 ：单

5、链DNA双链DNA 蛋白质 双链DNA RNA4、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心经染料-氯化铯密度梯度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布超螺旋DNA闭环质粒DNA开环质及线型DNA蛋白质石蜡油25离心分离设备离心机是生化实验室及生化工业广泛使用的分离设备。实验室用离心机以离心管式转子离心机为主，离心操作为间歇式。 工业离心分离设备中，较为常用的有管式和碟片式两大类。 27管式离心机碟片式离心机各种转子区带转子分析转子28管式离心机碟片式离心机29离心机的选用原则颗粒的大小、形状及硬度原料液的组成、密度及粘度产物热敏性30过滤 过滤速度 过滤设备 31过 滤 过滤操作是借助于过滤介质，在一定

6、的压力差P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。 过滤介质 : 过滤采用的多孔物质。织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、麻、羊毛及各种人造纤维与金属丝等 多孔陶瓷介质，此为特殊的介质，低温烧制，具有大量微细孔道的滤管或滤板（其他多孔材料，PE等） 膜分离介质，微滤分离等32（1）过滤推动力：悬浮液自身压强差、重力悬浮液的外加压力过滤介质的抽真空离心力（2）过滤阻力：介质阻力滤饼阻力大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。33（3）过滤速率Rm表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；L为滤液的粘度 34（4）过滤速度的强化a降低滤饼阻力如絮凝剂、凝固

7、剂助滤剂等。b降低滤液黏度 黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、调pH、选择合适的放罐时间。c降低悬浮液中悬浮固体的浓度过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。d. 对发酵液进行预处理，改善滤液性质。35过滤设备 内装微孔滤膜 进液口出液口微孔滤膜滤器3637生化分离中，工业规模过滤设备主要有加压叶滤机、板框过滤机、旋转真空过滤机。38板框压滤机 plate and frame filter 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固

8、体含量1-10%的悬浮液的分离。 392.2 细胞破碎理解：各种细胞破碎方法、原理、优缺点及其适用范围。 应用：采用不同的细胞破碎方法对细胞进行不同程度的破碎。 40一、概述大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质和一些有用酶包含在生物体中。41*细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种生

9、物细胞壁的组成和结构。42二、常见细胞壁的结构细菌酵母霉菌葡聚糖糖蛋白蛋白质几丁质43三、细胞破碎技术压缩/撞击作用剪切作用撞击法44机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂表面活性剂酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎四、细胞破碎方法及其原理45（一）机械法机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠

10、磨破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication）461 高压匀浆法高压匀浆又称高压剪切破碎。高压匀浆器的破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速(可达到450m/s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器的操作压力通常为50-70MPa。 474849高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、循环操作次数和温度。细胞破碎率S与操作压力P和循环操作次数N之间的关系可表达为细胞破碎率用胞内产物释放率表示,是单位质量细胞的产物释放量，mg/cell 50式中：S 破碎

11、率，为N次循环后，蛋白质的释放量R与最大释放量Rmax之比； k 与温度有关的速度常数； P 操作压力，MPa； 、b 与微生物种类和培养条件有关的常数。51高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20左右。团状和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般不宜使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度上升约2 310MPa，为保护目标产物的生物活性，需对料液作冷却处理，多级破碎操作中需在级间设置冷却装置。因为料液通过匀浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷却，可有效防止温度上升，保护产物活性。 522 珠磨法 bead mill珠磨是常用的方法细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂

12、（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机53（1）高速珠磨机工作原理磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动；细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起在出口处，旋转圆盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻璃小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻璃小珠。54 珠磨法破碎操作时，产生大量的热能。但有效能量利用率仅为1左右。 在设计操作时应充分考虑换热能力问题。 珠磨法适用于绝大多

13、数微生物细胞的破碎，但与高压均质法相比，影响破碎率的操作参数很多，操作过程的优化设计较复杂。55珠磨法(Bead milling)破碎细胞可采用间歇或连续操作。两种情况下细胞的破碎动力学均可近似表示 其中k为破碎速率常数 t在间歇操作时为破碎操作时间，连续操作时为细胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间 56式中：S 破碎率；k破碎速率常数；k与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。57 喷雾撞击法 细胞是弹性体，比一般的刚性固体例子难于破碎。将细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎的难度。喷雾撞击破碎正是基于这样的原理。 如下图，细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速

14、度为每分钟数千 ），形成粒径小于50微米的微粒子。高速载气(如N2，流速为300m/s)将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。喷雾撞击破碎的结构58 与珠磨法和高压均质法相比， 本方法中，细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的瞬间，细胞破碎程度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎的现象 细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器（线粒体、叶绿体等）的回收。 喷雾撞击破碎适用于大多数微生物细胞和植物细胞的破碎，通常处理细胞悬浮液质量浓度为100200g/L。实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50500mL，而工业规模的连续处理能力在1

15、0L/h以上。59 针对目标产物的性质（如相对分子质量、 分子形态、稳定性等），选择合适的细胞破碎法，并确定适宜的破碎操作条件是非常重要的。 如核酸相对分子质量很大，破碎中易受剪切损伤。 利用高压均质、珠磨、超声波和喷雾破碎等数种机械破碎器破碎大肠杆菌，提取质粒DNA的研究表明，只有珠磨法的完整质粒收率在90以上，而其他方法的收率低于50。 60超声波破碎 超声波破碎法(Ultrasonication)利用发射1525kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用(cavitation)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的

16、细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。 61JY92-II D超声波细胞破碎机62超声波破碎的适用范围超声波破碎适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。63不同机械破碎方法的比较64（二）化学和生物化学渗透酸、碱处理 化学试剂处理 酶溶 651、酸碱处理 蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用

17、酸碱调节pH值，可提高目标产物溶解度 。662、化学试剂处理 用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，Triton X100等)、螯合剂(如乙二胺四乙酸，简称EDTA)、盐(改变离子强度)或有机溶剂(苯、甲苯等)处理细胞，可增大细胞壁通透性。脲(urea)和盐酸胍(guanidine HCl)等变性剂(chaotropic agent)能破坏氢键作用，降低胞内产物之间的相互作用，使之容易释放。 673、酶溶 酶溶法(Enzymatic lysis)利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 68 外加酶法常用的溶酶溶菌酶

18、蜗牛酶葡聚糖酶蛋白酶纤维素酶糖苷酶肽键内切酶壳多糖酶69酶解法的优缺点 优点：发生酶解的条件温和。能选择性地释放产物。胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整。与机械法结合大大提高破碎率。缺点：溶解酶价格高。溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)。 70溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁；酵母细胞的酶溶需用Zymolyase(几种细菌酶的混合物)、-1,6葡聚糖酶(-1，6-dextranase)或甘露糖酶(mannanase)；破坏植物细胞壁需用纤维素酶(cellulase)。 71化学渗透法比机械破碎速度低，效率差，并且化学或生化试剂的添加形成新的污染，给进一步的分离纯化增添麻烦。但是，化学渗透法比机械破碎的选择性高，胞内产物的总释放率低，特别是可有效地抑制核酸的释放，料液粘度小，有利于后处理过程。 72（三）物理渗透法 渗透压冲击法冻结融化法73（1）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法通过渗透压的改变，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。74 （2）冻结融化法 将细胞放在低温下冷冻（约-15）