下游技术- 层析(上)-改课件

1、层析技术(色谱技术)Chromatography第一节 概论层析又称色谱或色层分离。属高度纯化技术。特点分离精度高、选择性强、应用范围广设备简单、操作方便。可在线检测、自动化操作应用物质成分的定量分析与检测；生物物质的制备、分离和纯化。原理根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法。互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。分离方法的根据电荷 Charge疏水性 Hydrophobic亲和性 Affinity分子量/体积大小 3D结构 层析的分类根据流动相的流动方式分： 轴向流层析、径向流层析根据洗脱时展开方式分： 洗脱展开、迎头分析(前沿分析)

2、、顶替展开(置换展开)层析的分类按机理分主要有：吸附层析疏水层析离子交换层析凝胶层析亲和层析层析方法的建立层析类型及填料的筛选柱床高度的确定流速的确定上样缓冲液的条件：组分、pH、离子强度上样条件的探索：压力、流速、样品浓度、检测波长、温度洗脱条件的优化：组分、 pH、离子强度、特异因子第二节 吸附层析吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。吸附层析过程通常包括： 待分离料液与吸附剂混合、 吸附质被吸附到吸附剂表面、 料液流出、 吸附质解吸回收预处理上样吸附洗杂洗脱再生常见的吸附类型及其主要特点物理吸附化学吸附吸附作用力 分子间引力化学键合力选择

3、性较差较高所需活化能低高吸附层单层或多层单层达到平衡所需时间快慢常用吸附剂吸附剂通常应具备以下特征： 对被分离的物质具有较强的吸附能力、有较高的吸附选择性、 机械强度高、 再生容易、 性能稳定、 价格低廉。活 性 炭（Active carbon）活性炭种类颗粒大小表面积吸附力吸附量洗脱粉末活性炭小大大大难颗粒活性炭较小较大较小较小难锦纶活性炭大小小小易活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，活性炭性能稳定，常用于脱色、脱臭、净化活性炭对物质的吸附规律活性炭是非极性吸附剂，适宜从水溶液中吸附非极性物质。针对不同物质，活性炭的吸附遵循以下规律：（1）对极性弱的化合物的吸附力大于极性强的化合物（2）

4、对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物;（3）对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物;（4）温度：未平衡前 随温度升高而增加。（5）pH 值的影响：碱性条件下吸附 酸性洗脱 酸性条件下吸附 碱性洗脱大孔网状吸附剂特点：脱色去臭效果理想；对有机物具有良好的选择性；物化性质稳定；机械强度好；吸附速度快；解吸、再生容易。但价格昂贵，吸附效果易受流速以及溶质浓度等因素的影响。大孔网状吸附树脂的种类非极性吸附树脂：苯乙烯交联而成，交联剂为二乙烯苯，又称芳香族吸附剂。中等极性吸附树脂：甲基丙烯酸酯交联而成，交联剂亦为甲基丙烯酸酯，故又称脂肪族吸附剂。极性吸附剂：丙烯酰胺或亚砜经聚合而成，

5、通常含有硫氧、酰胺、氮氧等基团。大孔吸附树脂的吸附机理 非离子型共聚物，借助于范德华力从溶液中吸附各种有机物，其吸附能力与树脂的化学结构、物理性能以及与溶质、溶剂的性质有关。通常遵循以下规律：非极性吸附剂可从极性溶剂中吸附非极性溶质；极性吸附剂可从非极性溶剂中吸附极性物质；中等极性吸附剂兼有以上两种能力常用的解吸方法低级醇、酮或水溶液解吸 原理：使大孔树脂溶胀，减弱溶质与吸附剂间的相互作用力碱解吸附 原理：成盐，主要针对弱酸性溶质酸解吸附原理同上水解吸附 原理：降低体系中的离子强度，降低溶质的吸附量第三节 凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography,GFC）亦称分

6、子筛层析（Molecular exclusion chromatography）在样品通过一定孔径的凝胶固定相时，由于流经体积的不同，使不同相对分子量的组分得以分离。分子筛凝胶层析原理凝胶过滤介质特点：亲水性高，表面惰性，不与溶质发生作用稳定性强，在较宽pH和离子强度范围内稳定，使用寿命长具有一定的孔径分布范围机械强度较高，允许较高的操作压力（流速）凝胶过滤介质葡聚糖凝胶：Sephadex G10-G200，传统的软凝胶过滤介质，目前仍广泛使用，但机械强度低。琼脂糖凝胶：SepharoseSepharose，常用，但机械强度较低；Sepharose CL，用环氧氯丙烷交联制备，机械强度较高凝胶

7、过滤介质Superdex：将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖珠体上制备的刚性凝胶，分离精度高，用于高效液相层析Superose：琼脂糖经二次交联制备的刚性凝胶，常用于高效IEC和AC。凝胶特性参数排阻极限：不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。分级范围：能被凝胶阻滞并相互之间可得到分离的溶质的相对分子质量范围。溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数凝胶粒径：多用筛目或微米表示。粒径越小，分离效率越高。床体积：一克干凝胶溶胀后所占有的体积空隙体积：层析柱中凝胶之间空隙的体积。分子筛凝胶层析的优、缺点优点： 操作简便，可采用恒定洗脱法分离效果好，重复性高，回收率高分离条件温和 介质

8、不需再生，易实施循环操作 分离机理简单，操作参数少，规模放大容易应用广泛缺点：分辨率低（根据分子大小的差别） 洗脱后产品被稀释分子筛凝胶层析的应用分离纯化脱盐相对分子质量的测定 在凝胶介质的分级范围内，蛋白质的洗脱体积与相对分子质量的对数成正比 对球形分子的测量精度高Desalting proteinsproteinssalts第三节 亲和层析亲和层析分离是利用溶质和固定相之间特殊的生物化学作用，从而实现分离。生物亲和作用生物物质，特别是酶与抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力；这种识别并结合的能力具特异性。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffin

9、ity）或简称亲和作用。亲和纯化的原理将具有亲和作用的两种分子中的一种分子与固体粒子或可溶性物质共价偶联，特异性吸附或结合另一种分子，使另一种分子（目标物质）容易从混合物中得到选择性分离纯化。亲和配基：亲和作用分子对中被固定的分子。原理亲和层析的特点效率高：利用亲和吸附可以从粗提液中一次性分离得到高纯度的活性物质。分离精度高：可用于分离含量极低，结构相近的化合物但通用性较差，洗脱条件苛刻亲和层析的操作载体活化、配基连接、吸附、清洗、洗脱、再生亲和吸附载体的种类种类组成性能多孔玻璃载体硅酸盐坚硬、耐酸碱、易修饰聚丙烯酰胺凝胶载体丙烯酰胺N,N-亚甲基双丙烯酰胺亲水性好可供活化基团多纤维素载体多糖

10、类物质来源丰富，但非特异性吸附及空间位阻强，对分离不利葡聚糖凝胶载体经环氧丙烷交联的多糖类理化性质稳定，但粒径太小载体的活化和偶联 亲和吸附的载体通常是惰性的，往往不能直接与配基连接，偶联前需要先活化，活化的方法主要有：溴化氰活化法：琼脂糖、葡聚糖引入亚氨基碳酸盐；高碘酸活化法：氧化多糖，生成烷基胺环氧化法：多糖类载体与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物，再与氨基偶联；甲苯磺酰氯法：双功能试剂法 二乙烯砜配基偶联方法 载体经活化后，就可以进行与配基的偶联反应。具体方法如下：碳二亚胺缩合法酸酐法叠氮化法重氮化法配基偶联方法间隔臂：当配基的分子量较小时，在配基和载体之间连接的基团，增大配基和载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。P303洗脱特异性洗脱： 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过竞争性结合作用，脱附目标产物。 特点：条件温和，有利于保护目标产物的活性和提高纯度。非特异性洗脱： 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和作用，使之脱附。是较多采用的洗脱方法。影响亲和层析的因素配基浓度： 配