生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质-第15章-核酸的研究方法课件

1、第14章 核酸的物理化学性质第14章 核酸的物理化学性质第一节 核酸的水解 第一节 核酸的水解 核酸的水解核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水解核酸的水解核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基水一、酸水解 水解特点：1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定 一、酸水解 水解特点：二、碱水解 水解特点：1. RNA的磷酸酯键易被碱水解；而DNA对碱稳定H2O磷酸三酯二、碱水解 水解特点：H2O磷酸三酯生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件三、酶水解 专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶（nuclease) ；水解

2、核酸的酶种类很多 1核酸酶的分类 (1) 按底物专一性分核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。(2)按对底物作用的方式核酸内切酶(endonuclease)核酸外切酶(exonuclease) 既可内切，也能外切 的核酸酶三、酶水解 专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶（nuclea(3) 按磷酸二酯键断裂的方式在3-OH与磷酸基之间断裂在5-OH与磷酸基之间断裂 (3) 按磷酸二酯键断裂的方式 2核糖核酸酶类 (1)牛胰核糖核酸酶；简称RNaseI或 RNaseA ；只作用于RNA，不作用于DNA。十分耐热。具有极高专一性的内切酶，其作用点为：嘧啶核

3、苷-3-磷酸与其他核苷酸之间的连键，产物为3-P-嘧啶核苷酸 2核糖核酸酶类 (1)牛胰核糖核酸酶；简称RNaseI或 3脱氧核糖核酸酶类 (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ：此内切酶切断双链DNA或单链DNA成为以5-磷酸为末端的寡聚核苷酸。需镁离子(或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。 (2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNase) ：此酶降解DNA成为3-磷酸末端的寡聚核苷酸。最适pH 45，需0.3 molL钠离子激活，镁离子可以抑制此酶。 3脱氧核糖核酸酶类 (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNase(3) 限制性内切酶 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷

4、酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的分子生物学百科全书的统计数字，仅型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上。(3) 限制性内切酶 限制性核酸内切酶，是一类能够识在上世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制和修饰系统。在上世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上核酸内切限制酶的类型 特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶 具有一种共同亚基的双功能的酶核酸

5、限制内切酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份 2种不同的亚基 核酸内切限制酶的类型 特性I型II型III型限制和修饰活性单切割位点在距特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于特异性位点或其附近距特异性位点3，端2426bp处甲基化作用的位点特异性的位点特异性的位点；一般为A或C特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割 能 能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大切割位点在距特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位型核酸限制性内切酶的基本特性它具有三个基本特性： a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b. 2

6、个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c. 因此，断裂形成的DNA片段具有互补的单链延伸末端。型核酸限制性内切酶的基本特性它具有三个基本特性：a. 识别位点：能够识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸序列；切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。a. 识别位点：能够识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸 5-CTGCA G-3, 5-CTGCA G-3,（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3-OH的单链粘性末端，3-G ACGTC-5， 3-G + ACGTC-5，(b) EcoRI切割位点,切割后形成5-P的单

7、链粘性末端， 5-G AATTC-3 5-G + AATTC-33-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5 （c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。 5-GAT ATC-3 5-GAT + ATC-33-CTA TAG-5 3-CTA TAG-5 核酸内切限制酶的命名法（1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母，组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。 （2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。 （3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个

8、不同的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。核酸内切限制酶的命名法（1）用属名的头一个字母和种名的头两第二节 核酸的酸碱性质 第二节 核酸的酸碱性质 1碱基的解离核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离，核酸的酸碱性质与此有关。由于嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮以及各取代基具有结合和释放质子的能力，所以这些物质既有碱性解离又有酸性解离的性质。 1碱基的解离核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离，核酸的酸例如：胞嘧啶的解离胞嘧啶环所含氮原子上有一对未共用电子，可与质子结合 ；此外，胞嘧啶上的烯醇式羟基与酚基很相

9、像，具有释放质子的能力，呈酸性 例如：胞嘧啶的解离胞嘧啶环所含氮原子上有一对未共用电子，可与例如：腺嘌呤的解离例如：腺嘌呤的解离2. 核苷酸的解离 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子。带负电荷的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相等，这时的pH即为此核苷酸的等电点 pI = (pk1+pK2)/2pK1值是由于第一磷酸基-P03H2的解离，pK2是由于含氮环N+H-的解离，2. 核苷酸的解离 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介质，第三节 核酸的紫外吸收 第三节 核酸的紫外吸收 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和

10、核酸在240290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在21. 核酸样品纯度和含量的鉴定 从A260A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A 260A280应大于1.8，纯RNA的A 260A280应达到2.0 对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可算出含量。通常以1A=50ugmL双螺旋DNA或40ugmL单链DNA(或RNA)，或20ugmL寡核苷酸计算 1. 核酸样品纯度和含量的鉴定 从A260A280的比值即对于不纯的核酸可以

11、用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外灯下粗略地估计其含量。 对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后，经溴化乙锭染有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系数来表示： (P)=A/c l 一般天然DNA的(P)为6 600，RNA为7 7007 800。单链多核苷酸的(P)值比双螺旋结构多核苷酸的(P)值要高。核酸发生变性时，(P)值升高，此现象称为增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收）复性后(P)值又降低，这现象称减色效应。测定核酸的(P)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。 有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系数来表示： (P)=A

12、第四节 核酸的变性、复性及杂交 第四节 核酸的变性、复性及杂交 一、核酸的变性(denaturation) 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。 一、核酸的变性(denaturation) 变性指核酸双螺旋1. 引起核酸变性的因素 （1）温度；加热到80100 （2）酸碱度改变 （3）化学试剂：尿素 、甲醛 1. 引起核酸变性的因素 （1）温度；加热到80100 2. 核酸变性的特点（1）一系列物化性质也随之发生改变 ：紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变等（2） 变性作用发生在一个很窄的温度范围内 。通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时

13、的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在8295之间 2. 核酸变性的特点（1）一系列物化性质也随之发生改变 ：紫3. 影响Tm值的因素 (1) DNA的均一性 。越均一，DNA熔解温度发生在一个很窄的温度范围之内 (2) G-C之含量 。G-C对含量越多，Tm值越高 3. 影响Tm值的因素 (1) DNA的均一性 。越均一，(3) 介质中的离子强度 。一般说在较高的离子强度时，DNA的Tm值较高，而且熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。(3) 介质中的离子强度 。一般说在较高的离子强度时，DNA二、复性 (renaturation) 变性DNA在适当条件下，又可

14、使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性1. DNA复性的特点：（1）许多物化性质又得到恢复 （2）将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性 （3）DNA的片段越大，复性越慢。（4）DNA的浓度越大，复性越快。 二、复性 (renaturation) 变性DNA在适当条件2. Cot l/2 衡量复性反应的速度快慢的指标Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，t为时间，以秒表示，Cot l/2表示复性一半的Cot值 在DNA浓度相同的情况下， Cot l/2与基因组的大小成正比2. Cot l/2 衡量复性反应的速度快慢的指标在DNA三、核酸的杂交 (hyb

15、ridization) 1. 定义：将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子。DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。是分子生物学和分子遗传学的研究中应用极广的技术。三、核酸的杂交 (hybridization) 1. 定义：2. 常见杂交的类型（1）Southern blotting（2）Northern blotting （3）Western blotting 2. 常见杂交的类型（1）Southern blotting（1）. Southern印迹杂交将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在

16、适当的滤膜上，然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段由于它是由ESouthern于1975年首先设计出来的，故叫做Southern DNA印迹转移技术。（1）. Southern印迹杂交将在电泳凝胶中分离的DNA生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件（2）Northern blotting 1979年，发展出了一种新的方法，将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由此可见，这种方法同DNA印迹杂交技术十分

17、类似 （2）Northern blotting 1979年，发（3）Western blotting将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做Western蛋白质杂交技术。（3）Western blotting将蛋白质从电泳凝胶中转第15章核酸的研究方法Nucleic Acid第15章Nucleic Acid 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分离、提纯和定量测定 制备天然核酸必需采用温和的条件，防止过酸、过碱，避免真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶

18、于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl去除蛋白质：水饱和酚，氯仿异戊醇。DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇（一）DNA分离纯化（一）DNA分离纯化制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：所有容器都要经过高温处理，不能高温高压的用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）处理。加入强变性剂（如胍盐）使RNase失活；在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂（如RNasin)（二）RNA的分离制备RNA时，最重要的是使RNase灭活：（二）RNA的分离（三）核酸含量的测定（三）核酸含量的测定2、定糖法 RNA：核糖 糠醛 绿色物质（670-680n

19、m） DNA：脱氧核糖+二苯胺兰色物质（595-620nm）苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法1个A50g/ml 双链DNA 40g/ml RNA或单链DNA2、定糖法苔黑酚/地衣酚浓HCl浓硫酸1、紫外吸收法3、定磷法 核酸含磷量为9.5% 1g磷相当于10.5g核酸4、琼脂糖凝胶电泳 溴乙锭能插入DNA分子的碱基对间形成复合物在紫外线照射下溴乙锭发橘红色荧光 荧光强度与DNA含量成正比3、定磷法纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染纯RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染（四）、核酸纯度的测定OD260OD280纯DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染

20、（四）、核酸二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来二、核酸的沉降特性与超速离心 不同构象的核酸（线形、环形8M CsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml1.55g/ml平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力=0 +4.22（r2 - r02） 10-10 ：浮力密度 ：角速度（弧度/秒）r：样品到转轴的距离（一）核酸密度的测定8M CsCl，45000rpm，16h（一）核酸密度的测定G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系=0.1 xG-C + 1.658xG-C

21、 =（-1.658） 10 （二）测定DNA的G-C含量G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系（二）测定DNA的RNADNA变性DNA双链DNA 蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的构象RNADNA（三）研究核酸的构象（四）用于核酸的制备超螺旋DNA或（四）用于核酸的制备超螺旋DNA或用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。三、核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。三、核酸的凝胶生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件用于小片段DNA的分析相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。PAG

22、E中一般不含RNase，用于RNA分析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）用于小片段DNA的分析（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（一）DNA的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定（一）DNA的酶法测定四、核酸的核苷酸序列测定英国 Sanger1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。 英国 Sanger生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件末端终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。末端终止法Sang

23、er生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNAMOV : MCB4.0Dideoxy sequencinDNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTPDNA序列分析仪：（二）DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert所发明。 其基本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反应，可使末端标记的DNA分子切成不同长度的片断，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放

24、射自显影得到测序图谱 （二）DNA的化学法测序：4组特异的反应如下：（1）G反应：用硫酸二甲酯DMS使鸟嘌呤上的N7原子甲基化，加热引起鸟嘌呤脱落，多核苷酸链可在此处断裂（2）G+A反应：用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，从而使其糖苷键变得不稳定，再用哌啶使键断裂（3）T+C反应：用肼使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基（4）C反应：当有盐存在时，只有C与肼反应，并被哌啶除去。嘧啶使修饰碱基脱落，并使去掉碱基的磷酸二酯键断裂4组特异的反应如下： 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT在G处： 32p ，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GC

25、TA在T处：32P-GC和32P-GCTACG生物化学I-第14章-核酸的物理化学性质第15章-核酸的研究方法课件硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）： *A*ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC*ACTTCGA C*ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACT T *ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。32P *ACTTCGACAG硫酸二甲酯（G）： 肼/Nacl（C）： 从下往上读：C（三）RNA的测序 RNA的测序方法有3个：（1）用酶特异切断RNA链：（2）用化学试剂裂解RNA（3）逆转录成cDNA（三）RNA的测序1995年K.Mullis发明。基本步骤为：1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物2.优化反应体系：包括适量模板、引物