生物芯片 生命科学前沿 教学课件

1、生物芯片一， 生物芯片开展历史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray生物芯片技术与传统杂交检测方式的比较 生物芯片技术从本质上说与Southern Blotting或Northern Blotting相同,只是探针密度极高而已。操作自动化程度一次可检测的序列个数总体效率生物芯片简便很高极大很高传统杂交复杂很低很小很低 早在八十年代初有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量的遗传信息进行分析和检查，但直到高密度探针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该设想逐步成为现实。走近生物芯片 通过机器人自动打印或光引导

2、化学合成技术在硅片、玻璃上制造的生物分子微阵列，芯片上集成有成千上万个与生命相关的信息分子，从而实现对蛋白质、核酸、细胞或其它生物组分进行准确、快速、大信息量的筛选或检测。为“后基因组方案时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的开展提供了强有力的工具，为整个人类社会带来深刻广泛的变革。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。二、生物芯片技术的概念生物芯片技术是指通过微阵(Microarray)技术将高密度DNA片段以一定的顺序或排列方式使其附着在,如玻璃片等固相外表，再以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。基因芯片的根本构

3、造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.基因：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是的外观探针支持物剖面图平面局部放大meta(2,1)meta(2,2),2)meta(3,1),1)meta(3,2),2)meta(4,1),1)meta(4,2),2)meta(5,1),1)meta(5,2),2)meta(6,1),1)meta(6,2),2)meta(7,1),1)meta(7,2),2)meta(8,2),2)meta(9,1),1)meta(9,2),2)meta(10.2),2)meta(11.1)1)meta(11.2)meta(1,1)me

4、ta(1,2)Barcodemeta(8,1),1)meta(10.1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 meta/ row(A)1 2 3 4 . . .141 2 3 4 5 . . . 31sub/ column(D)sub/ row(C)meta/ column(B)1 2ABCDGBACC62133AF020338Human 10K / Mouse 11K 生物芯片的分类(一)按载体材料分类玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。(二)按点样方式分类原位合成芯片、微矩阵芯片。 (三)按芯片固定的生物分子类型分类基因芯片、蛋白质芯片和芯片实验室 基因芯片技术(gene chip):

5、就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布，进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。Comparison of DNA Chip Technologies Oligo-Chip cDNA-Chip Genomic Chip 8 n or 20 n 50,000 nsequencingexpressionexpressiongenomic analysis蛋白质芯片(protein chip):就是选择一种能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体)的固相载体，在上面按预先设计的方式固定大量蛋白质(抗原或抗体)，形成蛋白质的微阵列，然后

6、参加与之特异性结合的带有特殊标记的蛋白质分子(抗原或抗体)，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的互检。芯片实验室(lab-on-chip):是将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料外表，制造出能够对微量样品进行变性、别离、纯化、电泳、PCR扩增、加样及检测等微小结构，使过去一个实验的各个实验步骤微缩于一个芯片上,这种技术称为芯片实验室。三，基因芯片技术的根本原理与方法1，将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；DNAs (cDNAs, synthesized oligonucleotides)Solid support (glass, plastic,

7、metal, silicon)2，样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针RNA labelling cDNA labelling reaction Buffer 10 xdNTP mixture 1mM Cy3-dUTP or Cy5-dUTP RNase inhibitor AMV reverse transcriptaseHybridized probes (DNA or RNA molecules) are fluorescently labeled用于标记的荧光基团化学结构SO3-NSO3-NNH(CH2)5NHNOOOHOHOPPPOC

8、y3-UTPSO3-NSO3-NNH(CH2)5NHNOOOHOHOPPPOCy5-UTPCyanine dye550nm 570nm colour649nm 670nm colour3、分子杂交样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。与经典分子杂交的区别：杂交时间短，30分钟内完成可同时平行检测许多基因序列影响杂交反响的因素：盐浓度、温度、反响时间、DNA二级结构按碱基配对原理将两者进行杂交Work on the biochemical principle of DNA/DNA or DNA/RNA hybridization4、检测分析 芯片经杂交反响后，各反响点形成强弱不同的光信号图像，对

9、相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，得到待测样品的相应信息。 Result of analysis基因表达谱gene expression pattern)BiologicalSampleFunctionalInformation红色 上调黄色 不变绿色 下调通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。计算Ratio 值 (Cy3/Cy5)。进而获取初步功能信息。An effect of size 1 corresponds to a 2-fold change in expression0.5-2.0 之外的定义为在两样本中有明显差异表达 演示基因芯片根本

10、原理总图四，芯片的制备制备方法根本上可分为两大类原位合成和预合成后点样。预合成后点样：是指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经合成好，点样系统需要做的就是把这些合成好的样品涂在载体上。原位合成：是指利用光导合成的方法在载体外表上逐个合成寡核苷酸，合成后点样可能将十几至几十个碱基的寡核苷酸或几百个碱基的cDNA片段固定到载体上制成寡核苷酸芯片或cDNA微阵列。1 支持物的预处理载体材料要求：1，载体外表必须具有可以进行化学反响的活性基团，以便与生物分子进行偶联。2，载体应当是惰性的和有足够的稳定性。惰性:是指载体的其他性能或特异性吸附都不应该干扰生物分子的功能。稳定性:是指在进行分子杂交或结合时，

11、可能遭受一定的压力或酸、碱条件而不发生变化。主要以玻璃片、硝酸纤维素膜或硅片为载体，实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其外表衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜,通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。方式：预先合成DNA或制备基因探针 然后打印到芯片上已克隆的基因片段PCR，RT-PCR扩增的基因片段人工合成的DNA片段2，DNA微矩阵列的制备3 芯片的制作生物芯片制备中材料的固定方式主要包括1，原位合成法2，点样法接触式点样法非接触式点样法原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷酸原位光刻DNA合成技术。以单核苷酸或其他生物大分子为底物，在

12、玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，从而制备成芯片。此方法的优点是可以在较小的区域内制造大量不同的探针在1cm2面积上合成40万组寡核苷酸。光导原位合成接触点样法：是将样品直接点在载体上，其优点是仪器结构简单、容易研制。可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。每个样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。非接触式点样法喷墨法:通过压电晶体或其他推进形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。在1cm2面积上可喷射10000个点。喷墨打印技术基因芯片的特点微型化和自动化。现已出现的芯片最小仅有1cm,;每个阵列中阵点样品DNA的用量

13、仅为5nl(0.5g/L)左右;同时杂交和洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅度提高。高度平行性。基因芯片技术是将待研究的基因制作成芯片,并在同一张芯片上同时对实验组和对照组材料进行杂交分析,从而使实验结果具有可比性.巨大的信息产出率。在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、时间与空间上的差异及遗传信息。高度敏感性和专一性。能可靠并准确检测出10 pg/l的DNA样品。 生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的根底研究价值，又具有明

14、显的产业化前景。目前，基因芯片和蛋白质芯片作为生物芯片的代表，已经走出实验室，开始产业化了。TNF Ligand Family: Fasl (Tnfsf6), Tnf, Tnfsf10, Tnfsf12, Cd40lg, Cd70.TNF Receptor Family: Fas (Tnfrsf6), Ltbr, Tnfrsf10b, Tnfrsf11b, Tnfrsf1a, Cd40.Bcl-2 Family: Bad (Bbc2), Bag1, Bag3, Bak1, Bax, Bcl2, Bcl2l1, Bcl2l2, Bcl2l10, Bid, Bnip2, Bnip3, Bnip3l

15、, Bok, Mcl1.Caspase Family: Casp1, Casp2, Casp3, Casp4, Casp6, Casp7, Casp8, Casp9, Casp12, Casp14.IAP Family: Birc1a, Birc1b, Birc2, Birc3, Birc4, Birc5.TRAF Family: Traf1, Traf2, Traf3.CARD Family: Apaf1, Bcl10, Birc3, Birc4, Nod1, Card6, Card10, Casp1, Casp2, Casp4, Casp9, Cradd, Nol3, Pycard (As

16、c), Ripk1.Death Domain Family: Cradd, Dapk1, Fadd, Fas (Tnfrsf6), Ripk1, Tnfrsf10b (TRAIL-R), Tnfrsf11b, Tnfrsf1a.Death Effector Domain Family: Casp8, Cflar (Cash), Fadd.CIDE Domain Family: Cidea, Cideb, Dffa, Dffb.p53 and DNA Damage-Induced Apoptosis: Akt1, Apaf1, Bad (Bbc2), Bax, Bcl2, Bcl2l1, Bid

17、, Casp3, Casp6, Casp7, Casp9, Trp53 (p53), Trp53bp2, Trp53inp1, Trp63, Trp73.Anti-Apoptosis: Akt1, Api5, Atf5, Bag1, Bag3, Bcl2, Bcl2l1, Bcl2l10, Bcl2l2, Birc1a, Birc1b, Birc2, Birc3, Birc4, Birc5, Bnip2, Bnip3, Casp2, Cflar, Dad1, Tsc22d3, Fas (Tnfrsf6), Hells, Il10, Lhx4, Mcl1, Nfkb1, Nme5, Pak7 (

18、Arc), Pim2, Polb, Prdx2, Rnf7, Sphk2, Tnf, Cd40lg (CD40L), Zc3hc1 (Nipa). Mouse Apoptosis PCR Array Figure 1:How PCR Arrays Work - Protocol ChartPCR Arrays Yield Highly Reproducible ResultsPCR Arrays Amplify A Single Gene-Specific Product in Every Reaction.ECM & Adhesion PCR Arrays Revealed Up- and

19、Down-Regulated Genes生物芯片的应用正处在迅速开展中，并将在生活和生产的各个方面发挥越来越重要的作用。具体有哪一些应用呢？基因芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行比照分析。进一步说明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺

20、癌、前列腺癌、肝癌。基因表达分析： 人类基因组编码大约100,000个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的，因此，具有监测大量mRNA的实验工具很重要。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因。 自测健康 一分钟取血样，两分钟检测，三分钟出诊断结果！听起来就像是神化一样。然而有了生物芯片，这个神话就将变成现实，将来任何人随时随地都能自测健康状况，这就是它的神奇之处。 检测时，只需把血液滴在芯片上，其中的疾病基因就会和芯片上对应的基因发生化学反响而结合，用特制的电脑扫描仪已进行扫描后，计算机很快就能识别发

21、生反响的是哪一种疾病的基因，从而判断被检测者是患了哪种病。 个性化治疗 基因芯片能查出人与人的遗传基因的特性。这意味着将不再对所有患者采用千篇一律的治疗方法，而是针对个人，分别投以最有效的治疗药物或方法。 也许就在不久的将来，我们将会发现生物芯片就在你我身边！科学体检 不久的将来，传统繁复的身体检查可能将被基因芯片全面取代。在操作中，只要在人体上取一滴血，放到拇指甲大小的一块芯片上，便可以由计算机迅速自动诊断出被检者是否患有遗传病，以及其他可能存在的遗传缺陷，预测到你未来假设干年的健康回收到哪些威胁，以便采取相应的对策加以预防。 我国在生物芯片领域的开展 面对生物芯片的巨大产业，我国的科学家们

22、也积极行动，研制开发出我国自主知识产权的生物芯片，在医用生物芯片研究和工程技术的某些方面到达了国际先进水平。2000年10月，清华大学生物芯片研究开发中心程京教授在国际生物芯片技术大会上宣布，他们已经研制出世界上第一个1平方厘米大小的多力生物芯片平台系统。利用它可以在指甲大小的芯片上建立缩微实验室，用于医学根底研究、疾病诊断、司法鉴定、食品卫生监督、航天、环保等领域的分析检测。上述成果说明，虽然中国在生物芯片领域起步较晚，与美国、欧洲、日本相比在实际制作实物的能力方面，还有相当差距，但在某些想法和构思方面走到了国际前沿。开发新药 从经济效益来说，生物芯片最大的应用领域可能就是开发新药。目前已经

23、有多家制药企业介入芯片的开发。由于存在个体差异，可以说没有一种药物可以适用于所有的病人。因此，根据每个人的特有的基因开发出专用药物，即个性化药物，将成为药物治疗学上的一次质的飞跃。这就要快速分析病人的多个基因已确定用药的方案，基因芯片技术将是最正确选择。 杂交测序：人类基因组方案的实施促进了更高效率的、能够自动化操作的测序方法的开展。芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization,SBH)技术及邻堆杂交(contiguous stacking hybridization,CSH)技术即是一种新的高效快速测序方法。用含65,536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术

24、，可测定200bp长DNA序列，采用67,108,864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加那么提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。CSH技术弥补了SBH技术存在的弊端，CSH技术的应用增加了微阵列中寡核苷酸的有效长度，加强了序列准确性，可进行较长的DNA测序。计算机模拟论证了8聚寡核苷酸微阵列与5聚寡核苷酸邻堆杂交，相当于13聚寡核苷酸微阵列的作用。可测定数千个核苷酸长的DNA序列。 疾病的诊断与治疗：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达基因芯片在感染

25、性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体免疫应答反响，能及早诊断，待测样品用量小；能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型；极高的灵敏度和可靠性；检测本钱低，自动化程度高，利于大规模推广应用。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。 药物研究与开发：芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国传统的中药有效成分进行筛选。目前，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药

26、物的毒性或副作用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药学pharmacogenomics领域带动新药的研究和开发。 基因功能研究：在基因组学和后基因组学研究中，基因芯片也起到重要的作用。应用基因芯片可以开展DNA测序、基因表达检测、基因突变性、基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性SNP测定等研究。与传统的Northern blot杂交或点杂交方法相比，基因芯片技术具有大规模平行处理的能力。在营养与食品卫生领域的应用：采用基因芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将为揭示肥胖的发生机制及预防打下根底。还可用于营养与肿瘤相关基因表达的研究，如癌基

27、因、抑癌基因的表达与突变，营养与心脑血管疾病关系的分子水平研究。再者，食品营养成分的分析、食品中有毒、有害成分的分析和检测等。在环境科学领域中的应用：在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。 农业和畜牧业：利用基因芯片技术，对有重要经济价值的农作物和水果等的基因组进行大规模高通量的研究，筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，以开发高技术含量、高附加值的新产品。也可利用基因芯片技术筛选、开发高效低毒的生物农药。军事和司法：美国以有局部公司得到政府的资助开发生物战病原体检测系统。在司法领域，国外的公司正在开发便携式DNA芯片检测装置，它可以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储