细胞生物学研究方法翟中和第四版市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、第3章 细胞生物学研究方法第1页本章主要内容细胞形态结构观察方法细胞及其组分分析方法细胞培养与细胞工程细胞及其生物大分子动态改变模式生物与功效基因组研究第2页第一节 细胞形态结构观察方法病毒 20-200 nm支原体 0.1-0.3 m细菌 0.5-5.0 m动植物细胞 20-30 m活细胞多是无色透明直径第3页 显微镜观察范围 肉眼观察范围第4页肉眼 0.2 mm光学显微镜 0.2 m电子显微镜 0.2 nm扫描隧道显微镜样品制备技术分辨率第5页一、光学显微镜 (light microscope)从细胞发觉、细胞学说建立，直至今天光学显微镜依然是细胞生物学研究主要工具1. 目镜 2. 准焦螺

2、旋3. 物镜 4. 载物台5. 反光镜第6页（一）普通复式光学显微镜组成由3 部分组成：光学放大系统（目镜与物镜） 照明系统（光源和聚光镜）镜架及调整系统第7页（一）普通复式光学显微镜成像放大倒立虚像经物镜形成倒立实像经目镜深入放大成虚像第8页（一）普通复式光学显微镜分辨率分辨率：显微镜最主要性能参数分辨率是指能区分开两个质点间最小距离普通光学显微镜最大分辨率0.2 m: 光源波长N : 介质折射率, 空气为1, 油为1.4: 物镜镜口角(最大140o, Sin/2 最大0.94 )第9页 镜口角是指被观察点射入物镜前透镜边缘光线之间夹角。 第10页（一）普通复式光学显微镜样品制备Figure

3、 9-10, 11a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )石蜡切片H.E染色第11页（二）相差显微镜和微分干涉显微镜利用光线干涉原理，将相位差转换成振幅差，实现对非染色活细胞观察A. 当两束光相位相同时，相互干涉结果使光波振幅增加B. 当两束光相位相反时，则造成光波振幅降低第12页（二）相差显微镜和微分干涉显微镜相差显微镜是在普通光学显微镜基础上，添加 “环状光阑”和 “相差板”，将光程差或相位差，转换成振幅差体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A）和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果比较第13页（二）相差显微镜和微分干

4、涉显微镜微分干涉显微镜以平面偏振光为光源，使样品中厚度上微小区分转化成明暗区分分辨率比普通光镜提升了一个数量级录像增差显微镜能够用来直接观察颗粒物质沿着微管运输动态过程Figure 9-9 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第14页Four types of light microscopy (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known

5、 as bright-field microscopy (B) phase-contrast microscopy (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy (D) dark-field microscopyFigure 9-8 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第15页正置显微镜与倒置显微镜比较组成一样，倒置显微镜物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养活细胞，含有相差物镜。第16页（三）荧光显微镜基本原理荧光：分子吸收入射光

6、能量后电子从基态跃迁到激发态，再从激发态回到基态而发出可见光(波长比入射光长)第17页（三）荧光显微镜基本原理光源和光学系统与普通光学显微镜不一样关键部件是滤光片系统及专用物镜镜头滤光片系统由激发滤光片和阻断滤光片组成第18页1.照明方式通常为落射式 2.光源为紫外光或其它短波 长光 3.有两个特殊滤光片 (发射滤片和阻断滤片)第19页荧光显微镜光路系统第20页（三）荧光显微镜样品制备免疫荧光技术荧光素直接标识技术绿色荧光蛋白(GFP)基因与编码某种蛋白质基因相融合表示两种以上荧光素标识同一样品，可同时显示不一样成份在细胞中定位第21页（三）荧光显微镜应用在光镜水平上，对细胞内特异蛋白质、核酸

7、、糖类、脂质以及一些离子等组分进行定性定位研究有力工具荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（fibrillarin）（红色）等结组成份第22页（四）激光扫描共焦显微镜以激光为光源聚光镜和物镜同时聚焦到同一点上，排除焦平面以外成像利用激光扫描装置和计算机高速采集与处理汇聚每一个点上信息，形成清楚二维图像分辨率比普通荧光显微镜1.41.7 倍第23页（四）激光扫描共焦显微镜可经过“光学 切片” 叠加后重构出样品三维结构Figure 9-20 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )(二向

8、)第24页3D Image Reconstructionzxy第25页zxyzyy第26页荧光显微镜（a）和激光扫描共焦显微镜（b）第27页二、电子显微镜透射电镜 transmission electron microscope, TEM扫描电镜 scanning electron microscope, SEM第28页（一）透射电子显微镜 电子束作为光源电磁透镜聚焦镜筒高度真空图像经过荧光屏或感光胶片统计第29页1电子显微镜与光学显微镜基本区分Figure 9-42 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )

9、第30页 光镜 电镜光源 可见光（300-700nm）电子束 紫外光（200nm）分辨率 200nm 0.2nm透镜 玻璃透镜 磁透镜真空 无要求 1.33*10-310-5Pa电子束波长与加速电压相关。当加速电压为50100千伏时，电子束波长约为0.00530.0037纳米 第31页2电子显微镜分辨本事与有效放大倍数电子显微镜分辨率可达0.2 nm电镜分辨本事是指电镜处于最正确状态下分辨率第32页3电子显微镜基本结构电子束照明系统成像系统真空系统统计系统第33页（二）透射电镜制样技术超薄切片技术戊二醛和四氧化锇环氧树脂厚度40-50nm重金属盐超薄切片黑白图像第34页超薄切片技术显示细胞超微

10、结构应用超薄切片技术，几乎能够观察细胞各种超微结构Figure 9-45 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第35页（二）透射电镜制样技术负染色技术观察线粒体基粒、核糖体、蛋白颗粒及细胞骨架纤维甚至病毒等重金属盐沉积在铜网上，而样品未被染色（故名负染）分辨率可达1.5 nm 左右第36页（二）透射电镜制样技术冷冻蚀刻技术包含冰冻断裂与蚀刻复型两步观察膜断裂面上蛋白质颗粒和膜表面形貌特征，图像有立体感样品不需固定包埋 第37页冰冻蚀刻电镜照片 第38页透射电镜照片与冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜照片比较第39页电镜三维重构与低温电镜技术电镜

11、三维重构技术低温电镜技术电子扫描断层成像技术核孔复合物第40页（三）扫描电镜技术利用电子“探针”在样品表面进行“扫描”激发样品表面放出二次电子成像，能够得到样品表面立体形貌第41页（三）扫描电镜技术样品利用CO2 临界点干燥法处理样品观察前喷镀一层金膜普通扫描电镜分辨本事仅为3 nmFigure 9-49 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第42页小结：光镜、透射电镜与扫描电镜原理比较注意样品制备技术差异！第43页三、扫描隧道显微镜探测微观世界物质表面形貌利用量子力学中隧道效应含有原子尺度高分辨本事 能

12、够在真空、大气、液体等各种条件下工作非破坏性测量/wiki/File:ScanningTunnelingMicroscope_schematic.png第44页第二节 细胞及其组分分析方法第45页一、用超离心技术分离细胞组分差速离心：利用不一样离心速度所产生不一样离心力，将各种质量和密度不一样亚细胞组分和各种颗粒分开差速离心第46页一、用超离心技术分离细胞组分密度梯度离心：经过离心力作用使样品中不一样组分以不一样沉降率在密度梯度溶液中沉降，形成不一样沉降带第47页二、细胞成份细胞化学显示方法显色剂与细胞组分中特殊基团结合经过显色剂在细胞中定位及颜色深浅来判断蛋白质、核酸、多糖和脂质在细胞中分布

13、和相对含量第48页福尔根反应 Feulgen stain特异显示细胞内呈紫红色DNA 分布原理：酸水解能够去除RNA，仅保留 DNA，并除去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键嘌呤，使 脱氧核糖醛基暴露。所暴露自由醛基与希夫试剂 （Schiffs reagent）反应呈紫红色第49页三、特异蛋白抗原定位与定性细胞内特异蛋白显示可经过抗原抗体特异结合方法得以实现若抗体偶联荧光染料，则能够经过荧光显微镜、激光共焦显微镜观察为了观察特异蛋白在细胞内精细定位，抗体需偶联电子致密物(胶体金)，用电镜观察第50页（一）免疫荧光技术直接间接免疫荧光技术（A）间接免疫荧光技术（B）第51页（二）免疫电镜技术在超微结构

14、水平上研究特异蛋白抗原定位免疫胶体金技术受到越来越多青睐第52页四、细胞内特异核酸定位与定性原位杂交：用标识核酸探针经过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中位置第53页原位杂交技术光镜水平同位素标识或荧光素标识探针电镜水平生物素标识探针与抗生物素抗体相连胶体金标识结合 第54页FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)第55页五、定量细胞化学分析与细胞分选技术流式细胞术第56页 流式细胞术是对细胞进行快速定量分析与分选一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中细胞经过高频振荡控制喷嘴，形成包含单个细胞液滴，在激光束照射下，这些细胞发出散射光和荧光，

15、经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可依据这些性质分选出高纯度细胞亚群，分离纯度可达99%。（flow cytometer）。第57页/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html第58页应用1.分析细胞中DNA, RNA 含量和细胞表面分子含量2. 细胞、细胞组分分选第59页第三节 细胞培养与细胞工程/The_Origin_of_Hela_Cells第60页一、细胞培养动物细胞培养分为原代细胞和传代细胞细胞系：有限细胞系和连续细胞系细胞株：基本形态：成纤维样细胞和上皮样细胞贴壁培养和悬浮培养第61页动物细胞

16、培养原代细胞 110代以内细胞传代细胞 在体外培养条件下连续传代培养细胞接触抑制 贴壁生长细胞分裂生长到表面接触时停顿分裂 生长现象细胞系 （Cell line) 极少数细胞在传10代后可渡过危 机而传下去40-50代次并仍保持原来染色体二 倍体数量及接触抑制行为 有限细胞系 永生细胞系：细胞发生了遗传改变(染色体显著改 变)，有癌变特点细胞株（Cell strain) 单个细胞增殖而来，全部细胞含有相 同遗传性状.第62页当前试验室中惯用几个细胞系细胞系名称细胞类型起源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞人BHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PC12嗜铬细

17、胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠第63页一、细胞培养植物细胞培养单倍体细胞培养：用花药或花粉在人工培养基上进行培养，经过发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者通 过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株第64页一、细胞培养植物细胞培养原生质体培养：体细胞经纤维素酶处理去掉细胞壁原生质体经诱导分化长成植株第65页二、细胞工程第66页（一）细胞融合与单克隆抗体技术细胞融合灭活病毒化学物质（如PEG）电融合同核体（homokaryon）异核体（heterokaryon）合核体（synkaryon）第67页单克隆抗体与多克隆抗体第68页单克隆抗体制备第69页（二）显

18、微操作技术与动物克隆细胞拆合：胞质体，核体物理法：机械法或短波光化学法：细胞松弛素显微镜下用显微操作装置对细胞进行拆合或微量注射，如核移植、显微注射基因等第70页克隆羊多莉培育第71页第四节 细胞及生物大分子动态改变Martin D N , Baehrecke E H Development ;131:275-284第72页一、荧光漂白恢复技术亲脂性或亲水性荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联高能激光束照射使某一区域荧光不可逆淬灭因为生物膜流动性，淬灭区荧光强度逐步恢复测定脂质或蛋白质在细胞中运动速率第73页fluorescence photobleaching recovery

19、， FPRFigure 10-36a Molecular Biology of the Cell ( Garland Science )第74页二、单分子技术与细胞生命活动研究指在单分子水平上对生物分子行为(构象改变、相互作用、相互识别等）实时动态检测以及在此基础上操纵调控等第75页use optical traps to probe the stepping of single molecules of kinesinFluorescent image of single motor proteins (left): Motion of two diffusing kinesin molec

20、ules (green) on a microtubule (red) shown as a time series kymograph. Schematic (right): By dragging diffusing kinesin molecules with laser tweezers over a microtubule, the friction force between the motor and its microtubule track can be measured very precisely第76页三、酵母双杂交技术在体内分析蛋白质蛋白质相互作用利用转录激活因子DN

21、A 结合域(DB)和转录激活域(AD)结合在一起才含有完整转录激活功效原理第77页四、荧光共振能量转移技术(FRET)分子含有不一样能级：分子中外层电子，普通处于电子基态S0 (electronic ground state ) 最低振动能级吸收光能以后，它能够被激发到第一电子激发态S1任意振动能级。这过程发生在10-15s时间内被激发分子，首先释放能量回到S1最低振动能级，此过程发生在10-12s内；然后从S1最低振动能级回到S0各振动能级，并以光子形式释放能量，即发射荧光第78页FRET产生条件D、A都能发荧光D发射光谱和A激发（或吸收）光谱必须有部分重合D和A之间距离必须小于10nm。第

22、79页FRET 基本原理第80页检测活细胞内两种蛋白质分子是否直接相互作用假如两个蛋白相互作用，其中一个蛋白激发后发出荧光可激发另一蛋白产生荧光两个蛋白未相互作用相互作用第81页五、放射自显影技术利用放射性同位素电离射线对乳胶(含AgBr 或 AgCl)感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究两个主要步骤：即同位素标识生物大分子前体掺入和细胞内同位素显示第82页依据试验要求选择适当同位素研究DNA 合成时通惯用氚（3H）标识3H-TdR研究RNA 合成用3H-U在研究含硫蛋白分子代谢时，用 35S 标识蛋氨酸和半胱氨酸第83页对细胞或生物体内生物大分子动态研究和追踪：连续标识、脉

23、冲标识显微放射自显影电镜放射自显影第84页胰岛B细胞电镜放射自显影结果3H-亮氨酸脉冲标识完成10分钟后，被标识胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中3H-亮氨酸脉冲标识完成45分钟后，被标识胰岛素蛋白进入分泌颗粒内第85页第五节 模式生物与功效基因组研究Figure 1-44 Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition ( Garland Science )第86页一、细胞生物学研究惯用模式生物模式生物通常个体较小，轻易培养，操作简 单，生长繁殖快因为基因在进化上保守性以及遗传密码通用性，从一个试验生物得到相关基因性质或功效方面信息往往也适合用于其它生物第87页Why do we need model systems?All cells are descended from a common ancestorSimple systems to study a biological questionExtrapolate （外推）results to higher organismsAdvantageous characteristics found in model organismsAmenable to genetic manipulation Reproduce rapidlyTr