PCR实验室(相关资料)电子版本

1、PCR 实验室( 相关资料)精品资料精品资料仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢 PAGE 4PCR：即聚合酶链式反映(Polymerase，利用在体外时解旋（变性），55时引物与单链按碱基互补配关于的原则接合（退火），再调温度至 右，聚合酶沿着磷酸到五碳糖)的方向合成互补链（延伸）。温控设备，能在 之间很好地进行温度控制。根据PCR仪，原位 PCR仪，实时荧光定量PCR仪等几类。普通仪：一般把一次PCR 扩增只能运行一个特定退火温度的PCR 仪，称之为普通PCR 仪，也就是传统的PCR 仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。普通PCR

2、仪主要应用于科研、教学、临床医学、试验、检疫等。如:启步 BSW-2P,BSW-3P,ABI 2720 型梯度仪：反映能否成功，退火温度是关键，梯度仪每个孔的温度可以在指定范围内依照梯度设件（种温度梯度）的称之为梯度仪。不同的 NA片段其最适合的退火温度不同，经过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR 扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。梯度PCR 仪主要用于研究未知NA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约成本。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR 用。梯度PCR 仪多应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行

3、病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域以聚合酶链式反映）为特征的、以检测析。如启步型原位仪：是提取细胞或组织中的NA进行基因扩增反映，而原位是保持细胞或组织的完整性， 使NANA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶NA与细胞之间的关系。原位、等；（2）内源性基因片段，如人体的单 遗传病基因检测如实时荧光定量PCR仪：在普通的仪器。其扩增原理和普通扩增原理相同，在扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性接合扩增。扩增的结果经过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。荧光定量PCR 仪有单通道，双通

4、道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道； 有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。荧光定量PCR 仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品性业、科研院校等。荧光定量检测技术在临床诊断方面很多，主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断，如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。通道：chan el 指的是针关于每一种荧光的检测器，比如你在一个管中做多个颜色，针关于多个靶基因。每个颜色需要

5、一个检测器来检测荧光信号的强弱，每一个针关于不同颜色的检测器，就是一个通道。在使有些厂家5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使一种荧光染料是作为内参的，即参照和校正实验结果。的机器里显示为红色的水平线。如果你的扩增线在刚开始的时候就高于 表明有基因组NA污染。）或专用的 ，这些荧光染料都必需单独使用一个检测通道。这样以来，真正能检测多荧光信号的有效通道只有4专用的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。选择单通道实验还是多通道实验？这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并且用看家基因进行关于照，可以考虑选择多

6、通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR 反映以及探针要在同一个反映条件下进行，并且且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行关于照。硬件设计：孔板的荧光定量可以容纳的样本量大，而且无需特殊的耗材。有些传统的孔板的仪器采用卤钨灯激发检测，这些光学结构在孔板的顶部，每个样本孔距光源和检测器的光程各不相同

7、边缘效应，关于结果产生影响。为了保证精确、准确的实验结果，这类仪器在验进程中通常会使用一种荧光染料）或专用的 作为参照校正实验结果。卤钨灯 的使用寿命短、更换成本较高已经成为很多用户头痛的问题。在实验进程中卤钨灯作为一种热光源，、公司生产的荧光定量就属于这一种。创新的离心式的仪器通常选用激发检测，离心式的设计上避免了边缘效应光源是冷光源关于实验没有影响，因此无需采用其他荧光染料校正仪器，而且使用寿命长无需经常更换每次只能收集单个荧光信号，但是检测灵敏度高。但这类仪器运行速度非常快，但也存在样本量小、耗昂贵、没有梯度功能、存在时间积分等缺陷的系列和的 系列均为这一类仪器。在荧光定量PCR 仪的众

8、多技术参数中，升降温速度也是厂家喜欢大举宣传的指标。更快的升降温， 可以缩短反映进行的时间，而且缩短了可能的非特异性接合、反映的时间，提高PCR 的特异性。精品资料精品资料仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢 PAGE 6PCR实验室内部分区图图1试剂储存区图2标本制备区图3扩增区图4产物分析区一、PCR实验室布局PCRPCR实验室原则上为试剂准备区、样本制备区、扩增区和扩增产物分析区四个单独的工作区域并且设有专用走廊，各工作区域应设缓冲间，工作区与缓冲间宜安装连锁装置。不同功能的工作区应是分隔独力的，各工作区有鲜明的标志，不能直通，如果紧密相连

9、，需安装物品传递窗。前两区为扩增前区，后两区为扩增后区，扩增前区与扩增后区应严格分开。实验材料、试剂、记录纸、笔、清洁材料等，只能从扩增前区流向扩增后区，即从试剂准备区样本制备区扩增区后区，不得逆向流动。各工作区顶部应安装紫外灯，紫外灯的波长为254nm，每 20 一支 40W的紫外灯。二、PCR实验室各区功能及主要设备11、试剂准备区：主要进行试剂的制备、分装和主反映混合液的制备。试剂和用于样本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其它区域。试剂原材料必需贮存在本区内，并且在本区内制备成所需的试剂。本区主要设备有天平、冰箱、离心机、加样器、振荡器等。关于于气流压力的控制，本区并且没有严格的要求

10、。2、) 的合成。本区主要设备有冰箱、生物安全柜、离心机、加样器、振荡器、恒温水浴等。本区的压力梯度要求为：相关于于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。、扩增区：主要进行扩增。此外，已制备的模板( )的加入和主反映混合合液制备成反映混合液等也可在本区内进行。精品资料精品资料仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢 PAGE 11本区主要设备有：扩增仪、冰箱、离心机、加样器等。本区主要设备有：扩增仪、冰箱、离心机、加样器等。本区的压力梯度要求为：相关于于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。4、扩增产物分析区：扩增产物的测定。本区主要

11、设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等。本区主要设备有酶标仪、洗板机、加样器和水浴箱等。本区的压力梯度的要求为：相关于于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。三、PCR实验室通风系统及压力控制各区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实各区域之间应具备单向的实验工艺流、物流、人流与气流，形成单向流程的保护屏障，避免实验之间的相互干扰，防止气溶胶扩散关于实验进程造成污染。PCR实验室并且没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式，严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。四、PCR实验室装饰实

12、验室围护结构应牢固、气密性好；一切阴阳角宜采用圆弧过渡；墙体内壁光洁、不积尘、耐实验室围护结构应牢固、气密性好；一切阴阳角宜采用圆弧过渡；墙体内壁光洁、不积尘、耐侵蚀、易清洗消毒；地面使用侵蚀的要求。五、PCR实验室注意事项品制备区要放置生物安全柜和低温冰箱，空间应大一些。2、试剂准备区、样本制备区设紧急洗眼器，以保证操作人员的安全。33、PCR实验室没有严格的净化要求，可以根据用户的使用情况和资金的投入选择。病理诊断试剂及配套设备全系列的产品，涵盖了液基细胞学、免疫组织化学和分子基因诊断。病理诊断试剂及配套设备全系列的产品，涵盖了液基细胞学、免疫组织化学和分子基因诊断。芯片技术等先进技术相关

13、的仪器、试剂和耗材。沉降式全自动制片染色系统：根据人体不同类型细胞其比重不同的特点，尤其是病变细胞比重大、沉降速度快，与特殊处理后的载玻片相互吸引，从而最大程度地捕捉病变细胞和具有诊断价值的成沉降速度快，与特殊处理后的载玻片相互吸引，从而最大程度地捕捉病变细胞和具有诊断价值的成分，自动湿染色，最终制成背景清晰、诊断线索明确的单层细胞薄片。全自动沉降式制片染色系统每批次可以处理1-24 个标本，每天 7 小时可以处理300 张制片，单片独力滴染，染液一次性使用，避免样本交叉污染。沉降式全自动液基细胞学制片染色系统广泛应用于宫颈癌筛查，同时诊断痰细胞、尿液细胞、浆膜腔细胞、针吸细胞和内窥镜细胞。荧

14、光原位杂交（FISH）：FISH 是在细胞水平上检测染色体数目和基因数目及结构异常的分子生物学技术，其基本原理是用荧光标记的核酸探针，经过变性退火，和样本中碱基互补序列特异性接合成NA双链，然后经过荧光显微镜检测分析。由于FISH 技术具有直观、快速、敏感性高和方便灵活的特性，已经广泛应用于肿瘤遗传学、基因相关疾病的分型和肿瘤个体化治疗等领域。液相芯片技术是以,生物分子间的反映在悬浮液态体系中进行的一类新的生物芯片技术。在这个灵活和开放的平台中可进行蛋白质、核酸等生物大分子的检.液相,逐渐进入了临床诊断领域。液相基因芯片：将预先人工合成的寡核苷酸探针共价连接于微球表面构成。液相基因芯片除具有一

15、般固相基因芯片的功能如核苷酸测序、单核苷酸多态性分析、基因作图等，还具有精确的同时定性、定量分析特征。液相蛋白芯片：临床检测囊括：1 抗原抗体定量定性检测；2 细胞因子检测。测序技术第一测序技术第一Sanger链终止法一代测序技术是世纪年代中期由及其同事首先发明。其基本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链NA分子区分开来。链。用双脱氧核苷 酸作为链终止试剂（基团，所以 可被用作链终止试剂）经过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链延伸引物。（双脱氧核苷酸）分析四组样本。从得到的胶上可以读出我们需要的序列。第二大规模平行测序大规模平行测序平

16、台）的出现不仅令NA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权能够被众多研究人员分享。新一代 深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美 公司的基因组测序仪、美国I公司和英国公司合作开发的I测序仪美国公司的测序仪。I测序的基本原理是边合成边测序。在 等测序方聚合酶合成互补链时，每添加一种处理，从而获得待测的序列信息。以I测序仪说明二代测序的一般流程文库制备，将用雾化或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶片段切成平末端，紧接着磷酸化并且增加一个核苷酸黏性末端。然后将I测序接头与片

17、段连接。簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头片段变性成单链后与测序通道上的 接头引物接合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。经过不断循环获得上百万条成簇分布的链待测片段。）测序，分三步聚合酶接合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一循环开始前将接合的核苷酸剪切并且分解。数据分析-第三高通量、单分子测序被称为第三代的测序的单分子测序仪的技术和公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量、低成 本、长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖模板与固体表面相接合然后边合成测序，第三代分子测序

18、，不需要进行扩增。单分子测序技术。该测序是鉴于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小分子片段并且用末端转移酶末端加以及在的末端进行光标记和阻断，把这些小片段与带有) 的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置， 荧光标记脱氧核苷酸进行合成，每次只加入一种脱氧核苷酸，然后将未参与合成的聚合酶洗脱，直接关于3成像，观测模板位 合物，进行下一轮反映。技术。该测序也是鉴于边合成边测序的原理，这项技于使用了 ) 。测序的进程：被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链接合（每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记），被激发出荧光，在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸集团被切割并且释放，聚合酶转移到下一个位置，下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲，进行下一个循环。的