蜈蚣多糖对Hela细胞的增殖抑制作用研究

1、蜈蚣多糖对Hela细胞的增殖按捺作用研究李兴暖韩雅莉余卫国【摘要】目的研究蜈蚣多糖对人宫颈癌细胞Hela细胞的按捺作用及作用机制。要领用TT法检测蜈蚣多糖对Hela细胞生长的按捺作用；流式细胞仪和AnnexinV-FIT/PI双荧光染色别离检测蜈蚣多糖对Hela细胞周期及凋亡环境的影响。结果在必然浓度范畴内蜈蚣多糖可明显按捺Hela细胞的增殖，改变Hela细胞的细胞周期，使细胞停滞于G2/期，并能诱导细胞凋亡。结论蜈蚣多糖大概通过改变Hela细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡，从而对Hela细胞的增殖有必然的按捺作用。【关键词】蜈蚣多糖；细胞周期；细胞凋亡Keyrds:PlysaharidefrSl

2、pendrasubspinipesutilans;ellyle;ellapptsis少棘蜈蚣SlpendrasubspinipesutilansL.Kh别名百足,属节肢动物门，多足纲，唇足目，螟蚣科动物，为?中国药典?纪录的正品药材，为我国传统的镇痉、通络类药物。故国医学纪录和临床理论均已证实其具有平静熄风、通络止痛、解毒散结等药用成果1。当代药理实行也证实白蜈蚣具有抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等作用2,3，临床用于治疗肿瘤以及心脑血管病等症。传统中药均以整虫入药，但蜈蚣体内身分庞大，且有用身分尚不明白，无法对其药理作用做进一步研究。为了探究蜈蚣抗肿瘤作用，本文以少棘蜈蚣为质料，对其体内多糖举行了分

3、散纯化，并进一步对其举行了Hela细胞增殖的作用的研究，为进一步探究蜈蚣抑瘤作用机制奠基基矗1质料1.1质料少棘蜈蚣SlpendrasubspinipesutilansL.Kh购自汕头市恒青药店，由广东产业大门生药研究室对其举行种类断定。人宫颈癌Hela细胞，由汕头大学医学院分子病理实行室提供，微血管内皮细胞VE，由汕头大学多学科研究中央提供。1.2试剂与仪器DEAE-52为hantan公司产物；1640造就基、胰卵白酶、噻唑兰TT、碘化丙啶PI均购自Siga公司；AnnexinV-FIT/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技能；新生牛血清购自杭州四序青生物。TherLabsystes酶标仪T

4、her公司；ShelLab二氧化碳造就箱；EpisXL流式细胞仪Bakanulter公司；倒置显微镜、荧光显微镜lypus公司；Niknlpix4500数码相机。2要领2.1蜈蚣多糖(plysaharidesfrSlpendrasubspinipesutilansL.Kh,SSP)的制备少棘蜈蚣87g研钵磨碎，参加1000l蒸馏水90恒温水浴搅拌4h，过滤，残渣参加500l蒸馏水，重复上述步调，过滤，归并滤液，浓缩滤液。取上清液，加5倍体积95乙醇4静置留宿，离心，去上清液，沉淀用少许蒸馏水溶解。Sevag法去卵白数次4，将去卵白溶液透析枯燥，过DEAE-52离子互换纤维素色谱柱，以0.05，

5、0.1，0.2，0.4和1lL-1Nal举行阶段洗脱，共得到3个糖峰，此中浓度0.05lL-1的Nal洗脱峰糖含量最高，网络此组分透析枯燥，待用。2.2Hela和人微血管内皮细胞(Huanirvasularendthelialell,VE)的造就取对数生恒久的Hela和VE细胞接种于含10小牛血清的1640造就基中，接种浓度为5105个/l，置37，52浓度，饱和湿度的二氧化碳造就箱中造就24h。去原造就基，参加含有SSP浓度别离为0，0.5，1，1.5，2，4g/l的维持液含1.5小牛血清的1640造就基，置造就箱中继承造就24h和48h后举行实行。2.3蜈蚣多糖SSP对Hela细胞增殖的影

6、响取对数生恒久Hela细胞按上述要领接种于96孔板中，贴壁造就24h，去原造就基，参加含有0.5，1，1.5，2，4g/lSSP维持液，总体积为200l，别离造就24，48h后取出，每孔参加TT20l继承孵育4h，吸去上清，参加200l二甲基亚砜，振荡15in，酶标仪检测570n波长下各孔吸光值A，按以下公式盘算细胞增殖按捺率。细胞增殖的按捺率%1实行组A值/比较组A值100取VE细胞作为正常细胞比较，实行要领同上。2.4蜈蚣多糖SSP对Hela细胞周期的影响取对数生恒久Hela细胞，接种到50l造就瓶中，按上述要领造就，贴壁造就24h后取出，参加含有SSP浓度别离为0.5，1，1.5g/l维

7、持液中，造就24，48h后通例消化网络细胞，用PBS洗濯3次，参加70预冷乙醇4结实留宿，离心去乙醇，用PBS洗濯两次，RNaseA50g/l37消化30in，PI染色后上机检测细胞周期变革5。2.5蜈蚣多糖对SSPHela细胞凋亡的影响将盖玻片切成4块，参加12孔板中，取100l5104个/l的细胞悬液加到玻片上，4h后待细胞贴壁后再参加900l造就基，继承贴壁造就20h。去掉原造就液，用PBS洗濯3次后，参加含0.5，1，1.5g/lSSP维持液，24h后，将玻片取出放入AnnexinV-FIT/PI染液中染色15in，荧光显微镜下不雅察并照相6。2.6统计学要领实行所得数据均表现s的情势

8、,数据用SPSS11.0软件统计，差异浓度处置惩罚组之间举行t查验，当P0.05为差异明显，P0.01为差异极明显。3结果3.1蜈蚣多糖SSP对肿瘤细胞增殖的影响见表12。实行结果表白，在必然剂量范畴内SSP对Hela细胞增殖有按捺作用。由表1所示，作用24h时，0.5，1，1.5和2g/lSSP对Hela细胞增殖有显着按捺作用；而SSP为4g/l时，对Hela细胞增殖有促进作用；作用48h时，0.5，1和1.5g/lSSP对Hela细胞增殖有必然按捺作用，2和4g/lSSP对Hela细胞有促进作用。表白SSP在24h内对Hela细胞按捺作用较强，且在低剂量下按捺作用显着。表1SSP对Hela

9、细胞的影响略表2为同样条件下SSP对正常细胞VE增殖的影响。作用24h时，0.5，1，1.5g/lSSP对VE细胞增殖按捺作用不显着；作用48h，各剂量SSP对VE细胞均具有促进增殖作用。说明SSP对肿瘤细胞的按捺作用较正常细胞显着。表2SSP对VE细胞的影响略3.2蜈蚣多糖SSP对Hela细胞周期的影响流式细胞仪检测结果表现，作用24h时，各剂量SSP组G2/期细胞所占比例均显着多于比较组，但各剂量SSP处置惩罚48h时各时相细胞所占比率与比较组比力差异不明显。说明在24h范畴内SSP对Hela细胞作用明显。表3SSP对Hela细胞周期的影响略3.3蜈蚣多糖SSP对Hela细胞凋亡的影响细胞

10、凋亡早期细胞膜上产生PS磷脂酰丝氨酸外翻，标识表记标帜了FIT的AnnexinV能与PS外翻的细胞结合产生绿色荧光，PI可以透过凋亡晚期细胞或殒命细胞的细胞膜，使其细胞核染成赤色。实行结果见图1，空缺比较组仅有少量细胞着绿色荧光，说明PS外翻很少，细胞没有出现凋亡的特性。而3个SSP处置惩罚组均有较多细胞着绿色荧光和少量细胞着赤色荧光，说明细胞PS外翻严峻，均产生了必然程度的细胞凋亡和殒命。4讨论已有资料报道蜈蚣油性提取物可以或许按捺肝癌细胞的增殖7，蜈蚣含有类组胺物质的构造提取物对胃癌、肝癌细胞有按捺作用8，而对SSP组分按捺肿瘤的研究如今尚未见有报道。细胞增殖实行结果表现，SSP对Hela

11、细胞增殖有显着按捺作用。为进一步分析SSP按捺Hela细胞增殖的机制，我们从细胞周期角度深化研究。由流式细胞仪检测结果表现，SSP可使G0/G1和S期细胞淘汰，而G2/期细胞增多，提示SSP可改变Hela细胞增殖生长周期，使细胞停滞于G2/期，按捺细胞周期历程。凋亡是细胞固有的自动灭亡历程，在维持构造稳态中起着极紧张的作用，细胞凋亡受阻是导致肿瘤发病和耐药的重要病理学底子之一，肿瘤细胞周期的改变通常和细胞的凋亡有关，AnnexinV-FIT/PI双荧光染色检测结果表现SSP可使Hela细胞的凋亡增长，表现了SSP诱导肿瘤细胞凋亡的作用。TT法检测细胞增殖和流式细胞术检测细胞周期均表现SSP对H

12、ela细胞的影响，在药物处置惩罚24h较48h结果显着，说明SSP对Hela细胞的有用作用时间短；SSP对Hela细胞的按捺作用浓度仅在必然范畴内其作用1.5g/l摆布，浓度过高会促进细胞增殖，其机理如今尚不明晰，有待于进一步实行证实。【参考文献】1王贤纯.蜈蚣的药用研究希望J.动物学杂志,2002,37(3):88.2周永芹,韩莉.中药蜈蚣的研究希望J.中药材,2022,31(2):315.3张艳慧,司秋菊,王鑫国.蜈蚣抗家兔动脉粥样硬化的实行研究J.中药药理与临床，2022，21(1):26.4董英,张艳芳,孙艳辉.水飞蓟粗多糖脱卵白要领的比力J.食品科学,2022,28(12):82.5BenP,ytetry.Ahighthrughputapprahte