内容文本生化下nucleic acid properties

1、Nucleic Acid PropertiesParts: Nucleic acidsHistory of DNANucleotides are the building blocks of nucleic acidsDNA StructureNucleic Acid Properties(一)物理性质形状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。 DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DN

2、A的一级结构:（磷酸二酯键） 构成DNA的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序，通过3,5-磷酸二酯键相连形成的线形结构。(二)核酸的水解5533糖苷键 由戊糖和碱基缩合而成。糖和碱基之间以糖苷相连接。糖的第一位碳原子(C1)与嘧啶碱的第一位氮原子(N1)或与嘌呤碱的第九位氮原子(N9)相连接。所以，糖与碱基间的连键是N-C键，一般称之为N-糖苷键。(二)核酸的水解：核酸的水解可以分为酸碱水解和酶水解（一）酸或碱水解碱易水解磷酸二酯键，DNA和RNA对酸或碱的耐受程度不同，DNA对碱相对较稳定。 RNA的2OH基在碱的作用下形成磷酸三酯，既不稳定，随即水解为2，3环磷酸酯酸易水解N糖苷键，嘌呤碱基比嘧

3、啶碱基易被酸水解，RNA相对较稳定。 (二）酶水解按底物分：RNA酶(RNase)，DNA酶(DNase)按作用方式分：核酸内切酶，核酸外切酶按作用键分：水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶按作用键分：水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶 限制性内切酶 限制性内切酶是一类重要的作用于DNA的内切酶。限制性内切酶术语来自一种现象，即某些细菌可以通过特异地破坏侵入的病毒DNA来阻止嗜菌体的感染。这样的细菌称之限制性宿主，因为它们可以限制外源DNA的表达。 限制性宿主可以合成核酸酶，该酶可在特殊的序列区降解外源DNA，但宿主细胞本身的DNA并不受该核酸酶的作用。这是因为宿主DNA可被内切酶识别的

4、特殊部位的某些碱基已经被甲基化了，内切酶不能催化已修饰底物的水解。所以任何进入宿主细胞的，在酶识别的特殊部位没有甲基化的DNA都会受到限制性内切酶的切割。限制性内切酶 核酸限制性内切酶可以识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶，现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。限制性内切酶酶分子识别位点切割位点 限制作用是否需用 ATP类 三亚基双功能酶 二分非对称至少在识别位点外 1000b

5、pYes类内切酶与甲基化酶分子不在一起4-6bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性No类二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称在识别位点下游 24-26bpYes限制性内切酶可分为三类类限制性内切酶 类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如Sma: 5-CCCGGG-3)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 酶切反应的操作步骤 设计酶切体积为2030l，计算清楚酶切系统中各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分

6、后，分装；先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10 x酶切缓冲液，混匀；在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶；加入适量的DNA样品；弹匀，短暂离心；置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切13小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大;置65水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行;进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;反应体系： 10内切酶缓冲液 2l DNA 1-1.5g 限制性内切酶 2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l，37 1小时。可根据需要按比例放大。 pGFPuv和pBSK的酶切体系

7、： 酶切体系质粒载体（pGFPuv和pBSK）10RE buffer (E)6 l100BSA0.6 lDNA6 gEcoR I0.6 lHind III0.6 lddH2OX l 合计60 l充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，于37保温3-4小时或过夜，65保温10分钟使限制性内切酶失活。 酶的定义: 在标准条件下,1小时完全消化1g线型DNA分子所需的酶量定义为1U；影响限制性内切酶活性的生物因子：酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；识别序列在DNA中的分布频率；与DNA的构象有关（SC,L,OC）；DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）； 内切酶用量不超过总反应体积

8、的10%；消化时间适当延长有利于提高酶活性；加DNAse-free的BSA 可以起到稳定酶活性的作用；用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性；酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用；DNA样品应不含重金属离子。 DNA的连接在T4DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步：T4DNA 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 Theoretical Basis of Agarose Gel Electrophoresi

9、sAgarose is a polysaccharide from marine alage that is used in a matrix to separate DNA moleculesBecause DNA ia a (-) charged molecule when subjected to an electric current it will migrate towards a (+) polePouring an Agarose Gel123456789Sizing a Piece of DNAThe distance the DNA migrates is dependen

10、t uponthe size of the DNA moleculethe secondary structure of the DNAthe degree of crosslinking in the gel matrixSize of DNA molecule can be determined by using standards of known molecular weight 1. a standard curve is made by plotting the molecular weights of the standards and the distance each fra

11、gment has migrated from the 2. measuring the distance the unknown fragment migrated from the well 3. substituting the distance the unknown migrated into the equation of the line of best fit, and solving for Y (the molecular wt)二、核酸的解离 核酸的碱基、核苷和核苷酸都能发生解离 1. 碱基的解离：嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮 2.核苷的解离：由于糖对碱基的解离的影响，增强

12、酸性 解离 3.核苷酸的解离：磷酸基引起的两个解离常数 pk10.7-1.6 pk25.9-6.5pK1 = 0.9第一磷酸基pK3 = 6.2第二磷酸基pK2 = 3.7含氮环腺嘌呤核苷酸pK1 = 0.7第一磷酸基pK3 = 6.1第二磷酸基pK2 = 3.7含氮环烯醇式羟基鸟嘌呤核苷酸pK1 = 0.8第一磷酸基pK3 = 6.3第二磷酸基pK2 = 4.3含氮环胞嘧啶核苷酸pK1 = 1.0第一磷酸基pK3 = 6.4第二磷酸基烯醇式羟基尿嘧啶核苷酸pH离子化程度小牛胸腺DNA的滴定曲线pH三、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱分子中均具共轭双键体系，在紫外区有吸收（240-290nm，最大

13、吸收在260 nm左右）。DNA的紫外吸收光谱1.天然DNA2.变性DNA3.核苷酸总吸收值2202402602800.10.20.30.4波长（nm）光吸收123Hyperchromicity （增色效应） DNA solution characteristically shows an absorbance maximum at 260nm (in the UV region of the spectrum). If the same DNA solution is melted, the absorbance at 260nm increases. This property is te

14、rmed hyperchromicity. The hyperchromic shift is due to the fact that unstacked bases absorb more light than stacked bases.四、核酸的变性、复性与分子杂交1. 变性稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。 氢键断裂，不涉及到共价键的断裂。变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）变性因素 pH（11.3或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热变性DNA的变性过程是突变性

15、的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.442. 热变性和Tm影响Tm的因素GC对含量溶液的离子强度溶液的PH变性剂（G+C）% =（Tm 69.3） 2.44Tm vs GC ContentThermal Denaturation of DNA Tm: In the process of thermal denaturat

16、ion, Tm is a point at which 50% of the DNA molecule exists as single strands.Tm is primarily dependent upon 1) Base composition of that DNA molecule. 2) Chemical nature of the solvent and 3) the identities and concentrations of ions in the solutionWhen thermally melted DNA is cooled, the complementa

17、ry strands will again re-form the correct base pairs, in a process termed annealing or hybridization. 3. 核酸的复性变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性 （Renaturation)。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火” (annealing)。 退火温度Tm25复性影响因素 片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复

18、序列数目）/ 溶液离子强度 4.分子杂交 (Hybridization)DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。探针：用放射性同位素或荧光标记的DNA或RNA片段。点杂交：将核酸直接点在膜上，再与核酸杂交。Southern印迹法：将电泳分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜上，再进行杂交。Northern印迹法：将电泳分离后的RNA吸印到纤维素膜上再进行分子杂交。Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探

19、针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜 本章小结核酸是遗传物质载体的证明和研究历史 1944 Avery, MacLeod, and McCarty demonstrate DNA could “transform” cells. Some doubt remained. Avery repeated Griffiths experiment of combining heat-killed virulent IIIS bacteria with non-virulent IIR bacteria. In order to isolate the t

20、ransforming substance, he fractionated the heat-killed IIIS cells and selectively removed carbohydrates and lipids, leaving behind proteins and nucleic acids. 1952 Hershey and Chase confirm DNA is a molecule of heredity. proteins labeled with 35S DNA labeled with 32P 双螺旋模型（Watson和Crick于1953年提出）DNA双螺

21、旋（B-DNA）是两条反向平行的多核苷酸链围绕同一假想的中心轴缠绕形成的右手双螺旋。糖和磷酸形成每条链的骨架，暴露在螺旋的表面，碱基堆积在螺旋的内部，一条链上的碱基与另一条链上的碱基形成位于同一平面的碱基对。腺嘌呤总是与胸腺嘧啶配对（通过二个氢键），而鸟嘌呤总是与胞嘧啶配对（通过三个氢键）碱基配对，因此双螺旋中的一条链与另一条链互补。相邻碱基对的距离为0.34nm，沿着螺旋的长轴每一转含有10个碱基对，螺距为3.4nm。螺旋的表面形成大沟和小沟。碱基对之间的疏水相互是稳定双螺旋的主要力。 核酸的化学结构1.核酸是由构件分子核苷酸组成的线性聚合物，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

22、每一个核苷酸都是由一个戊糖（对于DNA是2-脱氧核糖，对于RNA是核糖）通过-N-糖苷键与一个杂环碱基（嘌呤或嘧啶）连接组成的，糖的5C位通过酯键连接一个磷酸基团。2. 每一个核苷酸的磷酸基团通过与相邻的另一个核苷酸的3羟基形成的酯键将各个核苷酸连接起来形成聚核苷酸和核酸。由于一个磷酸分别在两个核苷酸的3和5位都形成了酯键，所以连接两个核苷酸的含有两个酯键的桥梁称之为磷酸二酯键。核酸酶可以在3或5位水解二酯键。 3.嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤既出现在DNA中，也出现在RNA中，出现在DNA中的嘧啶碱基是胞嘧啶和胸腺嘧啶，而出现在RNA中的主要是胞嘧啶和尿嘧啶，但RNA中还存在少量的稀有碱基，如假尿

23、嘧啶、二氢尿嘧啶等。 4.核苷酸是核苷的磷酸酯，去掉磷酸基团后剩下的部分称之为核苷。如果核苷5端磷酸化，根据连接的磷酸基团的数目可以形成核苷一磷酸（通常说的核苷酸，如AMP、GMP等）、核苷二磷酸（如ADP、GDP等）或核苷三磷酸（如ATP、GTP等）。 5. 在核苷5端磷酸化形成一个酯键，同一个磷酸又可以在同一个核苷的3端再形成一个酯键，形成一个环核苷酸。其中的环胸苷酸（cAMP）和环鸟苷酸（cGMP）是生物体的第二信使，它们可以将细胞外激素的信息传递给细胞内，引起重要的生理效应。 6. 核酸的大小变化很大，他们可以与蛋白质非共价结合形成核蛋白，如染色质、核糖体和病毒颗粒。DNA是原核生物和真核生