西索米星(Sisomicin)菌种工艺规程

1、原料药事业部*生物工程有限公司题目：西索米星(Sisomicin)菌种工艺规程第1页共11页制定人：黄启鹏日期：编码：STP-JZGY-005-01审核人：日期：生效日期：批准人：日期：颁发部门：质量部分发部门：生产副总、总工程师、生产部、质量保证部、菌种中心l目的建立一个西索米星菌种工艺规程，供菌种中心人员统一操作，并作为制定相应标准操作程序的依据。适用范围菌种中心西索米星菌种生产工艺。责任者菌种中心操作人员，菌种中心、生产部、品保部负责人，总工程师对此工艺规程负责。目录1产品概述22原材料质量规格43生化反应及工艺流程图54工艺过程及质量控制65菌种保存86菌种选育87主要设备一览表0-T

2、OC o 1-5 h z8技术安全及防火9附页10修订简历产品概述西索米星(Sisomicin)是美国先令公司在70年代开发的一种广谱抗生素，属氨基糖苷类，以其为母核可合成另一种新抗生素奈替米星(Netilmicin),它具有疗效好，副作用小的特点。与大多数抗生素一样，西索米星也是一种由微生物发酵产生的次级代谢产物，国外多由伊尼奥氏小单孢菌发酵产生；国产西索米星是由福建省微生物研究所筛选得的伊尼奥氏小单孢菌澄江变种产生。目前我公司主要生产菌种为Y系列白色变株，其发酵生物效价可达1450u/ml抗生素名称西索米星化学名称O3一去氧一4一C一甲基一3一甲胺基一B-L阿拉伯糖吡喃糖基(14)O2,6

3、一二氨基一2,3,4,6四去氧一a一D甘油基一4一烯己吡喃糖基一(1一6)一2一去氧一L一链霉胺结构式NHCH3西索米星及其主要小组分、衍生物R1R2R3合成方式西索米星HC-3-OH-H生物合成主组分奈替米星HC-3-OH-CH2_5半合成抗生素66-40BHOH-H生物合成小组分抗生素66-40DHOH-H生物合成小组分主要产品产品名称分子式分子量西索米星碱(用于半合成)c19H37N5O7447.72硫酸西索米星(C19H37N5O7)2.5H2sO41385.43硫酸奈替米星(C21H41N5O7)2.5H2sO41441.54抗菌谱西索米星是一种广谱抗菌素，与庆大霉素(Gentami

4、cin)相似，对G+细菌(除链霉菌)，包括结核分枝杆菌的活性很强。对G-细菌，包括多数绿脓杆菌具有相当活性。Neti对一些G-杆菌都有较强抗菌活性。原材料质量规格生化试剂（分析纯或化学纯）2.2工业（规格）序号原材料名称规格控制项目质量标准1土豆淀粉工业外观含量水分洁白的粉末，具有光泽。78%37.0%12%冷榨：9%13%热榨：72%4酵母粉工业外观干燥失重蛋白质灰份淡黄色至浅黄棕色颗粒或粉末8.5%44.0%8%5蛋白胨工业外观水分总氮浅黄色至土黄色粉末13.0%6其他7碳酸钙工业外观含量白色粉末97.0%生化反应及工艺流程图化学反应过程(西索米星生物合途径)2一去氧链霉胺a巴龙霉胺b.庆

5、大霉素A21c抗生素JI20A.e庆大霉素X2庆大霉素A1,fg西索米星h抗生素6640B(的加入口一葡萄糖胺小)加入口一葡萄糖C3/：N一甲基胺化C4/：甲基化和差向异物化C6/：胺化(f)失去3/,4/-(OH)和4/-5/-不饱化C6/：胺化和4/-5/-不饱化C4/：甲基化和差向异物化3.2工艺流程图冷冻管341A48冷冻管341A482h摇瓶发酵斜面120h34156d生产能力测定种子341C卜并瓶车间一级罐482h3.3设备流程图备注：（a）（e）冷冻管（b）250ml备注：（a）（e）冷冻管（b）250ml母瓶种子1000ml菌丝瓶（用于车间进罐）（c）500ml茄子瓶斜面（d）

6、500ml种子瓶（f）250500ml发酵摇瓶4工艺过程及质量控制4.1各种培养基配比（%）原料名称固体培养基（%）摇瓶种子培养基（%）摇瓶发酵培养基（）土豆淀粉1.52.06.0葡萄糖0.50.5K2HPO40.05干酪素0.20.2玉米浆1.0MgSO40.05酵母粉0.10.5CaCO30.50.60.6琼脂粉2.3黄豆饼粉3消前pH7.10.17.10.1PH自然4.2生产能力测定控制适当的菌龄（镜检菌丝着色均匀，伸展，以10%的接种量移入发酵瓶，332深层培养110130小时止，放瓶。同时测定放瓶pH,并镜检菌丝形态，估计生物效价。用HSO酸化pH2.0以下手摇24匀后放置20分钟，

7、用新华1号滤纸过滤。滤液可进行生物测定，测定生产能力，或者滤液用KOH回调至pH7.0左右,再过滤的滤液用于生产能力测定。4.3装量规格名称种子瓶发酵瓶固体斜面瓶子规格500ml500ml250ml茄子瓶试管装量规格90ml80ml80ml17ml通气量每只棉塞2.5克两层纱布内包一层绒布棉花做成的棉塞4.4生产用供种斜面的制备在控制无菌情况下，吸0.71.0ml母瓶种子液，均匀涂在空白茄子瓶斜面上。塞好棉塞，扎好牛皮纸，放置341间培养56天后，收起来于4冰箱确定符合质量标准后备用。生产用菌丝瓶的制备取1个孢子子斜面用挖块法将菌苔块移入装有90ml种子培养基的500ml三角瓶内。341培养4

8、8h,观察外观颜色及结合镜检情况，符合种子质量要求的可并瓶用于生产。符合质量要求的10小瓶（500ml三角瓶装90ml量）并为1大瓶，并根据外观、无试、镜检确认无菌，符合质量要求可用于生产。质量控制标准各级工艺控制点项目工艺控制点供种斜面培养温度：341培养时间56天保存温度：4冰箱使用期限W45天摇瓶种子（菌丝瓶）培养温度341;培养时间482hr装量500ml装90ml培养基通气量：每只棉塞2.5克摇瓶机转速220240rpm偏心距25mm4.6.2各级质量控制标准项目要求项目质量要求供种斜面外观姜黄色生物效价800u/ml无菌检查无杂菌摇瓶种子（菌丝瓶）外观姜黄色镜检菌丝形态菌丝伸展成疏

9、松大丛，菌丝着色均匀，伸展。无菌度镜检及无菌试验无杂菌5菌种保存（采用冷冻管保存）为了防止生产菌种形态和生产能力的变异，以保持菌种的原始形态和特定的生产能力。所以菌种的保存具有重要性。目前菌种保存方法中，甘油保存较简便、适用，故我公司采用此法。冷冻管制备将18义200山口试管，1211灭菌25分钟，备用。冷冻管保藏菌种在无菌室内以严密的无菌操作，吸取6ml种子液，移入已灭菌的试管中。塞好橡胶塞，粘上胶布，并摇匀菌液每支试管均贴上标签，注明品种、菌号、日期，然后送入冰箱，深冷18至25保藏。6菌种选育筛选程序（流程）STP-JZGY-005-00西索米星STP-JZGY-005-00西索米星(S

10、isomicin)菌种工艺规程第 页共11页出发的.株西索米星（SisOmicin）菌种工艺规程STP-JZ出发菌株（100左右）（有时含底物）筛20株邛瓶/株稀样液虢有破埼珠的A泡式浮夜诱变谎语出发的.株西索米星（SisOmicin）菌种工艺规程STP-JZ出发菌株（100左右）（有时含底物）筛20株邛瓶/株稀样液虢有破埼珠的A泡式浮夜诱变谎语挑选菌落”数初筛第9页共11页1瓶/株24株冻受_高产埋冷冻管*_抱子斜血进罐考查分离和筛选菌悬液的制备选好出发菌株的斜面，用无菌吸管将10ml生理盐水吸入斜面，用竹签将菌苔轻轻刮下，倒入装有玻璃珠的小三角瓶内，塞上棉塞，置摇瓶机振打30分钟后，取下用

11、装有6层擦镜纸的漏斗过滤。滤液用作纯化或诱变处理。菌种纯化将菌悬液，按10倍的稀释法，逐一稀释至10-310-6，从适当浓度的稀释管中吸取0.05-0.2ml于事先备好的琼脂平板上,用刮棒均匀地涂匀;然后移入341培养。培养开始一周应每天将平皿转个方向（保证长出菌落分布均匀），并且在培养过程中注意观察和做好记录。待平皿上形成彼此分离的单菌落，挑取一定量菌落移入斜面（一菌落移入一斜面），移入341培养68天，初筛后取10%复筛，确定2-4株效价高的埋冷冻管，并做传代试验。同时测定产物活性（组分变化情况）。最后确定遗传性状稳定菌株留作生产备用。最后是培养基和培养条件的调整。一个突变株由于基因突变，

12、失去生理特性的平衡，同时也降低了原来环境条件的适应能力。所以对突变株选择适应环境至关重要。作为生产菌株必须是优良菌株：具有高产性能（相对而言）、遗传性状稳定、生产能力强、产孢子丰富、发酵性能好、周期短、有效组分高、广泛适应环境条件等。诱变物理诱变、化学诱变、复合因子处理等方法与纯化操作所不同的是利用诱变剂处理微生物，以诱变造成突变，微生物菌种突变的频率比自发突变有大幅度提高。物理诱变剂较广泛应用的有紫外线、X射线、快中子等。化学诱变剂种类繁多，常用的有硫酸二乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、5氟尿嘧啶、氮芥等。绝大多数化学诱变剂具有毒性，其中90以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不要直接用口吸

13、，要避免与皮肤直接接触，也要防止污染环境，造成公害。7主要设备一览表设备名称型号规格数量备注用途SWCJ1CU5苏净科研实验无菌净化台SWCJ2G2苏净无菌室生产双目日本产显微镜1镜检CH20OlympusDHG-9123A型1上海*实验设备公司电热鼓风箱GZX-DH-30X351上海*医疗器械厂摇瓶机ZHWY-3122c500ml8上海智城深层液体培养ZHWY-31221000ml8山东鲁抗深层液体培养超低温冰箱COOL1存放斜面、试SC-2381电冰箱KQ-101剂、沙土管等13C-50E1离心机台式802型1上海*器械厂离心圆形卧式压力蒸汽灭菌器RZZ沪-065-20061上海*仪器有限公司灭菌酸度计pHS25型1上海测定pH技术安全及防火技术安全包括防火知识，是企业每个职工必备常知。它关系到国家财产的安全，也关系到每个人的生命安危。工作人员工作时要保证工作环境整洁（一周一次大扫除，每天安排值日生负责当天事宜），坚持工作岗位，严格执行岗位安全操作法，严防事故发生。禁止在转动的设备上（摇瓶机、离