氟虫腈及其代谢物

1、 第1章 绪论1.1研究背景 农药，是如今的农业发展中主要用于防止病、虫与杂草对作物危害不可少的一种特殊物质，它对提高农作物产量具有非常关键的作用。而伴随着全球农业科技的快速发展与进步，农药的种类与数量也随之不停的增长，化学农药的施用已经逐渐成为预防以及治理病虫害的一种常用方法。农药被施加到农作物之后，大部分的农药会因为多种其他的原因而被转化，但是作物内部仍然残存着少部分的农药试剂。人类假如经常性的食用含农药超标的农作物，会严重的损害了人体健康，而这也正是农药试剂残留量问题的缘由。而在这几年里，因为有不少的农户忽略了对化学农药试剂的正确使用，而使农药残留以及污染问题、状况常常发生；农药的残留量

2、不仅严重超标，而且每一年还有不断增加的倾向。同时，伴随着种植以及栽培技术的不断创新，农残这一个问题将会变得更加严峻，而这也将会对人类的生命健康构成非常严重的潜在危害与威胁。农药残留,也就是指：当农药于使用后的一段时间里面，由于没能够被分解而残留于农作物、收获物、生物体以及土壤亦或者大气里的少量农药原体、有毒有害代谢物质、降解物以及杂质在内的一个总称1。被使用在作物中的农药，有一部分会依附在作物上，而一部分又就会散落于土壤、水体以及大气当中；而残留于环境中的农药，又会有一少部分被各种植物所吸收；它们可以直接借助植物蔬果、水体抑或者大气而进入到人体以及禽畜的体内；又或者通过庞大的食物链的流动，最终

3、都会进入到人体以及禽畜体内。其中氟虫腈作为一种新型农药已被广泛推广使用于各种农作物和蔬菜。1.2研究目的及意义1.2.1研究目的随着农产品的需求量的增长，为了促进农产品的收成，农药的使用越来越普及、广泛。其中农药的残留、生态污染、储存和加工过程的污染以及病原体已经成为了食品安全问题最为关键的影响因素。然而农药的残留不仅仅对于人类的生命健康还带给动植物极大的影响，危害生命健康。解决农残问题是保障农业产品的食品安全、提高农产品品质的关键。本文是以农药中的氟虫腈以及代谢物类的药物作为研究对象，探察出检测方法中的优化方案，凭借对农药残留分析的技术和超高液相色谱联合质谱（UPLC-MS/MS）技术所能达

4、到一定的认识和了解。其中本文优化了提取方法、提取溶剂、氮吹温度、净化柱的选择与质谱条件并通过超高液相色谱质谱联仪检测蔬菜水果中4种氟虫腈及其代谢物药物残留量。在提取与净化步骤中，对提取溶剂、提取振摇时间、洗脱液用量以及固相萃取柱进行研究，以便能够达到操作简单方便、检测效率明显提高、灵敏度高、分析时间短、定性定量的准确、各项技术指标均满足残留检测要求的目的，以期为氟虫腈及其代谢物药物残留量的检测研究增加一定的参考依据。1.2.2研究意义建立一种快速提取、净化、使用超高效液相色谱-质谱串联联用（UPLC-MS/MS)对氟虫腈及其代谢物的新方法。采取最优选择项优化技术，并广泛应用到类似农药的农药残留

5、当中，实验中还考虑到了基质效应，以该实验测出的基质效应为依据，方便日后再次测定氟虫腈及其代谢物类的残留量。1.3本章小结本章主要讲述了研究的背景，研究的目的及意义。研究背景描述了农药残留的危害，而目的是找到检测农残的快速检测方法，其意义在于能够方便日后检测。第2章 文献综述2.1农药残留的现状及危害2.1.1农药的影响对环境的影响使用农药后，农药会流入河流、湖泊和池塘从而污染水资源，使得其水质变酸，从而导致河流、湖泊和池塘里的生物死亡或生病，特别对于鱼类的影响最为严重。对农药使用者的影响如果使用农药时使用方法不当，则可能会造成皮肤烧伤，腹泻或呕吐，严重时更加会造成生命健康的威胁。食物中的农药残

6、留大部分的农药都是有毒的，在使用农药后，农作物都会带有农药残留，令农作物中含有毒素。若果未遵守该农药的停药期规定，而提前采收，则会使得农药残留。或者使用不被允许使用在该农作物的农药，从而导致农药被该农作物吸收。例如在生姜种植时使用“神农丹”。2.1.2农药的分类以及危害有机磷农药有机磷农药属于广谱杀虫剂，主要有乐果、敌敌畏、敌百虫、氟虫腈等60余种。此类农药具有高效、易分解的性质，而且品种多，防治的对象以及效果都很可观，是我国农药使用数量而且生产总量最大的一类。因为有机磷非常不稳定，而且挥发性相当强，在自然环境中很容易分解，进入生物体内容易被酶分解，所以不污染环境，而且在食物中的残留时间也短，

7、因此引起的慢性中毒少，多为急性中毒。有机磷农药的毒性会危害人体的神经系统，人们倘若吃了施放了有机磷农药的生果、农作物等，容易造成肌肉震颤、高血压、心跳加快等等的症状，甚至昏迷死亡。而本实验中研究的氟虫腈则是典型的有机磷农药。有机氯农药有机氯农药属于高 HYPERLINK /subview/54604/54604.htm t /_blank 残毒农药，其中 HYPERLINK /subview/85931/85931.htm t /_blank 六六六、DDT等在我国早已禁用， 但是至今仍然有违规使用的情况，特别是毒杀芬、七O五四、林丹、 HYPERLINK /subview/122615/12

8、2615.htm t /_blank 氯丹等仍然在继续使用。有机氯的脂溶性非常强，而且不易水解和降解，非常的稳定，聚集在人体脂肪内，而且在自然环境中和食物中都能够长期的残留，停用后自然环境要至少要经过25110年才能够复原。食品受到有机氯的污染通常是从生活在水里浮游生物的捕食开始8，然后经由鱼类、虾类捕食浮游生物，到了最后进入以水产动物为食的鸟类、人体，它的富集程度已经达到了800多万倍。蔬菜水果以及其余的农作物都可以残留有机氯，而且动物性食品被污染的概率则大大的高于植物性食品8，而且不会因为其贮藏、 加工、烹调而减少， 很容易的进入到人体从而积蓄下来。 HYPERLINK /subview/

9、1666714/1666714.htm t /_blank 有机氯农药可导致急性或者 HYPERLINK /subview/2364791/2364791.htm t /_blank 慢性中毒。 HYPERLINK /subview/1311114/1311114.htm t /_blank 急性中毒可引发中毒者中枢神经的症状。因为此农药会贮藏在人体脂肪当中，所以急性中毒的可能较低、症状低微，一般为浑身没劲、头晕、反胃、睡不着 ；慢性中毒则可以造成人的肝、肾和神经系统损伤，DDT还具有致癌性。 HYPERLINK /view/2998778.htm t /_blank 氨基甲酸酯类农药氨基甲酸

10、酯类农药是应用很广的新型杀虫剂与除草剂， 如 HYPERLINK /view/143670.htm t /_blank 克百威、 HYPERLINK /view/143617.htm t /_blank 抗蚜威 、 HYPERLINK /view/442251.htm t /_blank 残杀威、 HYPERLINK /view/310115.htm t /_blank 西维因、 HYPERLINK /view/143693.htm t /_blank 杀螟丹等，在阳光和空气中就易于分解。其毒性与 HYPERLINK /subview/344072/344072.htm t /_blank 有

11、机磷非常的相似，但毒性较之比较轻，恢复得也快。一旦品尝了含有氨基甲酸酯类农药的蔬菜水果等农作物，中毒的人会发生和有机磷中毒比较一致的，但是因为其毒性比较轻，一般几小时就可以自行恢复。 HYPERLINK /view/11763653.htm t /_blank 拟除虫菊酯类农药拟除虫菊酯类农药是由人工合成的一类农药，以天然的除虫菊酯为原型，其杀虫效果较好，而且低残留低毒性，没有致癌和突变作用。主要有 杀灭菌脂( HYPERLINK /subview/314330/314330.htm t /_blank 速灭杀丁)、 HYPERLINK /view/1583675.htm t /_blank

12、氯氰菊脂(灭百可)、 溴氰菊脂( HYPERLINK /subview/2636770/2636770.htm t /_blank 敌杀死)等，对人类的毒性比较低，但是其具有蓄积性，中毒的表现症状为神经系统症状和皮肤刺激症状。2.2超高效液相色谱-质谱/质谱联用技术（UPLC-MS/MS)概述UPLC- MS/MS主要是由超高效液相色谱（Ultra Performance LC, UPLC）、接口装置(同时也是电离源)、质谱仪（MS）和质谱工作站软件等四部分组成。2.2.1UPLC-MS/MS的原理与特点超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatogra-

13、phy,UPLC) 技术是应小粒径填料(粒径105k Pa) 的要求而专门设计的，这种技术维持了原本的高效液相色谱技术的基本原理，不过这种技术的分离效能以及分离的效率都达到了非常大的提高,并且能够很突出地提高色谱峰的分离度以及增加检测的灵敏度，特别在质谱联用中更加可以突出这技术优越的性能。液质联用(LC-MS/MS)分析技术的逐渐成熟，了更为检测物体内代谢物的分析提供加简单、方便、迅捷的分析方法6，推动了药物代谢动力学的进步趋势。UPLC基本保持了HPLC的基本原理，其理论依据于范迪姆特(Van Deemter) 经验方程。在HETP=Adp+Bv-1+C(dp)2v式中，HETP是理论塔板高

14、度，A为涡流扩散系数传质因子，v为流动相线速度。可以直观地，dp是填料粒径，B为分子径向扩散系数，C为由该方程得出结论: 减少颗粒度不仅仅增加了柱效，同一时间还具有提速的效果。根据色谱柱中添加的固定相粒度dp的降低，色谱柱的理论塔板高度H同时得到了有效的降低，因其柱效提高，并且可以得到越加宽的线速度范围，从而达到分离以及分析的快速、精准和高效。超高效液相色谱使用了1.7m颗粒度的色谱柱作为它的填料，并且提高了了分析的通量、色谱峰大小及灵敏度，从而改进了一般情况下超高效液相色谱技术的缺点。2.2.2 UPLC-MS/MS技术的展望超高效液相色谱技术是一项比较新颖的检测方法, 其在敏锐性、分离和分

15、析速率等这些性能都比传统的HPLC好。UPLC-MS联用技术将超高效液相色谱技术的超强分离性能和质谱技术的高鉴别特点联合一起，发展成为了一个完美的现代分析技术, 并且可以相当好地适应到如今药物研究新发展。依据现今技术的不断进步，UPLC-MS一定可以在药品的研究方向中凸显出远比现在好的应用前景, 并且必将作为其发展的重要动力。 2.3氟虫腈及其代谢物概述2.3.1氟虫腈及代谢物简介氟虫腈，英文的通用名称为 Fipronil，锐劲特(Regent)是其商标的名称，化学名称(RS)-5-氨基-(2.6-二氯-4a-三氟甲基苯基)-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈基吡唑，氟虫腈是由法国的罗纳普朗克农

16、化公司在1987 年所开发研制的苯基吡唑类新型高活性杀虫剂，主要用于防治蔬菜、水稻、烟草、棉花、蓄牧业、公共卫生、贮存用品及地面建筑中各类别的作物害虫以及卫生害虫。 氟虫腈是作为一类比较创新且性能好的的灭虫农药，在全国范围内乃至国际上都被大量的利用。但是经由环境毒理学的探究竟然分析出了氟虫腈及其代谢物对于生态环境存在比较潜伏的不安全性，并且拥有对于神经系统有慢性毒性的作用。目前,氟虫腈已被我国列入为出口蔬菜残留监控的项目之一,但还没有相关的限量标准与残留分析方法标准。美国、日本、澳大利亚等国也对该农药极为的关注,均对其在食品中残留进行了规定。氟虫腈及其类似物是一类具有广谱杀虫效果的农药，对昆虫

17、具有胃毒作用，毒性较低，但过量的残留必然会对人畜或其他生物产生不良影响。据报道，氟虫腈原药对小鼠具有一定的肝毒性、神经毒性等，对水生动物、家蚕、蜜蜂等都具有较强的毒性，氟虫腈能够过量刺激啮齿类动物的甲状腺激素分泌，而有可能形成甲状腺癌；氟虫腈对人体的神经、消化和循环系统等都有明显的毒副作用。另一方面，氟虫腈在外界环境中能够代谢生成毒性更高的氟虫腈砜和氟虫腈亚砜等化合物。最常见的为氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜四种，其结构式见图2-1。氟虫腈R=SOCF3氟甲腈R=CF氟虫腈R=SOCF3氟甲腈R=CF3氟虫腈砜R=SO2CF3氟虫腈亚砜R=SCF3 图2-1氟虫腈及其代谢物结构图2.3.

18、2氟虫腈及其代谢物在环境的归趋 氟虫腈在水体中的降解氟虫腈在水溶液降解过程中，水环境的p H是引起降解的主要影响因子，水解动力学符合第一降解方程。氟虫腈在酸性(p H 5.5)和中性条件下稳定，而在p H 9.0下的半衰期是770 h、p H 10.0是114 h、p H 11.0是11 h、p H 12.0是2.4 h。RPA 200766是惟一检测到的水解产物，水解反应的机理是- OH亲核加成到极性的腈键，产生亚胺键并能互变异构成氨基化合物。 在氙灯照射下氟虫腈在酸性(p H 5.5)水溶液中的降解产物有MB 46513和RPA 104615(结构见表2-2)，光解反应常数为0.11 h-

19、1(MB 46513)和0.05 h-1(RPA 104615)，降解反应的过程中是脱硫反应和氧化反应1。但是在简单的水生态系统和模拟的稻田生态系中，氟虫腈主要形成MB 46513和MB 46136以及一些微量的极性产物，这一结果可能与环境中的微生物有关2。朱国念等发现在稻田生态系统的水体中氟虫腈主要通过光解和水解作用降解为MB 46513和RPA 200766；水体中的降解为光解水解还原作用；稻田环境中氟虫腈4种主要代谢物比原药降解快3。表2-1 氟虫腈及其已知代谢物结构通式 氟虫腈在土壤中的环境行为在稻田生态系统中，在土壤中则以氧化产物MB 46136和水解产物MB 45950(结构见表2

20、-1)为主，由于土壤微生物的存在，可以认为氟虫腈在土壤中的降解是生物和非生物因子共同作用的结果；在水稻植株中转化为氧化产物M B46136和还原产物MB 45950，表明植株体内氧化-还原酶系的代谢作用是氟虫腈降解和转化的主要因子。在稻田生态系中，代谢产物的出现比氟虫腈亲体化合物滞后23 d ；土壤中的降解过程中水解氧化光解还原作用；植株中的降解过程中氧化还原作用3。氟虫腈毒性作用机理氟虫腈与第一代氯离子通道阻断性杀虫剂来相比，氟虫腈显然具有更加优越的选择性。氟虫腈是作用于-氨基丁酸受体(GABA)，从而起到阻断由GABA控制的神经膜氯离子通道的作用，所以对多种经济害虫都具有防治作用。 研究人

21、员用原始培养的大鼠背神经后根神经节元进行单通道电压箱的实验，通过实验阐明了氟虫腈对于G A B A单通道的作用机制，氟虫腈能够缩短开放GABA的时间，并且延长GABA关闭的时间，即降低通道开放的频率来达到抑制G A B A 的效果，是引起的全细胞电流的原因4-6。2.4 果蔬样品前处理技术果蔬样品前处理以及检测是产品中农药残留分析的两个主要部分，其中果蔬样品前处理在整个分析过程中起着异常关键的作用。对于 UPLC MS /MS 而言，样品的前处理技术尤其关键，如果前处理净化不彻底会对分析仪器的灵敏度造成很大影响，进而影响结果的准确性和重现性。目前，前处理方法主要包括固相萃取、Qu ECh ES

22、 方法(分散固相萃取)、液相萃取 、固相微萃取 、基质固相分散、液相微萃取、超声辅助萃取、微波辅助萃取、加压溶剂萃取以及凝胶渗透色谱。固相萃取和 QuECh ES 方法以其优越的重现性、准确性和高效性被越来越广泛地应用于菜和水果中农药残留的同时测定7。2.4.1固相萃取固相萃取法概述固相萃取法，又称Solid-Phase Extraction，简称SPE，是近几年来快速发展起来的一种样品的前处理技术，经由固液萃取与柱液相色谱技术互相结合得来，其主要用于样品的分离、纯化与富集，固相萃取与传统的液液萃取比较，固相萃取法明显提高了分析物的回收率，并且更加有效的将干扰组分与分析组分分隔，从而达到了减少

23、样品前处理的过程、步骤，使得操作更简便、更省时。固相萃取法的基本原理和方法固相萃取法（SPE）基本原理和方法：固相萃取法（SPE）是基于液-固相色谱理论，使用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行分离、纯化与富集，是一种包括了固相以及液相的物理萃取过程，也可以把其视作一种简单的色谱过程。SPE利用了选择性吸附和选择性洗脱的液相色谱法分离原理。比较常用的方法是使液体的样品通过某种吸附剂，保留其中被测的物质，再选择使用适当强度的溶剂洗去杂质，然后用少量的良溶液去洗脱被测物质，达到快速分离净化以及浓缩的目的。或者可同时吸附被测物质与杂质，然后再选择使用合适的溶剂来选择性地洗脱被测物质。 2.4.2

24、Qu ECh ES 方法(分散固相萃取)QuEChERS方法概述QuEChERS方法（Quick快速、Easy简便、Cheap节约、Effective、Rugged耐用、Safe安全）是近几年来在国际上发展起来最为先进的一种对于农产品检测的快速样品前处理技术，其在2003年被美国农业部Anastassiades教授等开发出来的一种先进的技术。 QuEChERS方法原理QuEChERS方法的原理：使用乙腈作为提取剂萃取，然后使用萃取盐使得液-液分层，之后使用分散固相萃取，然后使用PSA以及其他吸附剂进行净化处理，从组分里除去脂肪酸、碳水化合物、色素，经过离心处理后，取得上层液进行分析。其简单来说

25、，原理跟固相萃取 （SPE） 和高效液相色谱 （HPLC） 相类似，其都利用了吸附剂的填料与基质当中的杂质相互的作用，吸附其中的杂质并且以此来达到净化除杂的目的。 QuEChERS方法的优点使用QuEChERS方法的优点比较多，其中优点可以在其名称中直接看出Quick快速、Easy简便、Cheap节约、Effective、Rugged耐用、Safe安全，另外此方法还具有以下的优势：（1）回收率比一般的方法要高，对于含有大量极性以及挥发性强的农药种类的回收率基本大于85%；（2）准确度以及精确度较高，并且可以使用内标法进行校正；（3）能够使用分析的农药种类多、范围广，其中包括非极性与极性的农药种

26、类都能够利用该技术得到比较好的回收率；（4）该方法分析速度快，能够在30min之内完成6个样品的处理；（5）各种溶剂的使用量相对较小，对于环境污染小，价格比较廉价而且不需使用含氯化物的溶剂；（6）操作起来简单方便，不需要受过专业培训或较高技能就能够很好地完成工序；（7）乙腈加到容器后便马上密封，工作人员接触的机会大大减少，减少对人体的危害；（8）在样品的制备过程当中基本不使用玻璃器皿，装置非常的简单。2.4.3液相微萃取液相微萃取概述液相微萃取（Liquid Phase Microextraction，LPME）技术被开发于1996年，作为一项新型的环保样品前处理技术，其伴随着环境的分析技术的

27、进步而发展起来，其具有快速、灵敏度高以及精确的优点。该技术集萃取、浓缩和采样与采样于一体，是一项对于环境非常友好的样品前处理技术，该技术适合于环境样品当中超痕量与痕量污染物的测定。液相微萃取的特点液相微萃取的特点：（1）该方法所需要使用的有机溶剂的量非常的少，一般情况下只需要几到几十微升，污染相对于其他的方法少得多；（2）集成了目标物的萃取、浓缩与纯化于一步，操作简单方便，并且劳动强度小；（3）使用液相微萃取方法不需要特殊的设备，而且操作成本低；（4）通过对萃取时使用的溶剂的pH值的调节可以轻松的实现选择性的萃取；（5）液相微萃取方法的应用可有效地降低基质效应的影响。2.4.4固相微萃取（SP

28、ME）固相微萃取（SPME）概述固相微萃取技术相比于固相萃取技术显得更加的简单，而且携带也比固相萃取技术更方便，操作的费用相比较也更为低廉，最重要的是固相微萃取技术解决了固相萃取技术回收率较低、吸附剂孔道容易堵塞等重要难题，因此次方法逐渐成为了试样预处理中最为广泛的方法之一。而现在固相微萃取法正在涉及到分析水、空气以及土壤等环境样品的分析当中。固相微萃取（SPME）原理以熔融石英光导纤维或者其他的材料作为基体支持物，利用相似相溶的特点，在它的表面上涂上性质互不相同的高分子固定相膜层，然后利用顶空或者是直接的方式，对待测物进行提取、进样、富集以及解析等操作。然后将已经经过富集之后的待测物的纤维转

29、移到分析仪器（一般是HPLC），然后进行解吸附（通常是溶剂解吸或热解吸）操作，最后进行分离分析。2.5本章小结本章主要论述了农药残留的现状以及农药的三大分类，了解了超高效液相色谱-质谱/质谱联用技术（UPLC-MS/MS)的原理与特点，并介绍了本论文主要研究的农药氟虫腈及其代谢物的性质以及对方方面面的危害，最后简单介绍了几种广泛使用的样品前处理技术。第3章 实验材料与方法3.1药品及试剂蔬菜、水果均为江门市各大大型种植基地抽检样品表3-1 实验药品种类规格用量表名称级别生产厂家乙腈色谱纯广州化学试剂厂氯化钠分析纯广州化学试剂厂无水硫酸镁分析纯Agilent Technologies乙酸钠分析纯

30、广州化学试剂厂甲酸色谱纯默克股份两合公司甲醇色谱纯默克股份两合公司氟虫腈标准（1000gL-1）农业部环境保护科研检测所氟甲腈标准（1000gL-1）农业部环境保护科研检测所氟虫腈砜标准（1000gL-1）农业部环境保护科研检测所氟虫腈亚砜标准（1000gL-1）农业部环境保护科研检测所正己烷色谱纯广州化学试剂厂乙酸乙酯色谱纯广州化学试剂厂3.2仪器设备表3-2 主要设备名称规格和数量表仪器设备名称型号 数量(台)生产厂家电子天平ALJ310-4N1KERN美国奥豪斯仪器(上海)有限公司高速台式离心机（Sigma）2-16PK1SIGMA固相萃取仪Supelco 24 位1Supelco超高效

31、液相质谱仪Waters Acquity Xevo TQ 1Waters氮吹仪N-EVAP1121南京铭奥仪器有限公司超纯水机Milli-Q1MERCK均质机FJ-2001上海本昂科学仪器有限公司恒温摇床HQ45Z1上海翰强仪器设备厂3-3 实验玻璃仪器规格数量表名称规格数量离心管10mL、50mL若干容量瓶10mL若干量筒25mL1个烧杯100mL若干滤膜0.22 m若干一次性注射器5mL若干NH2萃取小柱500mg若干移液枪5mL、1000 2支Flotisil（硅酸镁）小柱500mg若干C18萃取小柱500mg若干PSA小柱500mg若干GCB小柱500mg若干3.2.1仪器条件液相色谱的

32、分离条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（即2.1mm50mm，1.7m）；流动相：A：乙腈，B：10mmolL-1乙酸胺溶液；梯度洗脱的条件可查表3-4；进样量：1.0L-1；流速：0.20mLmin-1。表3-4 梯度洗脱条件表时间/min流量/mLmin-1A/%B/%曲线类型00.201090-3.00.2095565.00.2095566.00.201090质谱的分离参数 离子源：离子化方式为电喷雾电离，三重四级杆串联质谱；扫描方式：ESI-；检测打模式为多向反应检测模式即MRM；毛细管电压：205KV；离子源的温度：150；锥孔气的流量：50LHr；脱溶剂的气流量

33、：900lHr；碰撞室氩气的流量为0.2mLmin。氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的检测离子对、锥孔电压以及碰撞能量表可查看表3-5。表3-5氟虫腈类UPLC-MS/MS仪器参数序号种类定性离子/mz-1定量离子/mz-1锥孔电压/V碰撞能量/eV1氟虫腈 (Fipronil)434.90250.00434.90330.00434.90330.00 30 172氟甲腈(Fipronil-desulfinyl)387.00281.80387.00350.00387.00281.80 20 303氟虫腈砜(Fipronil sulfone standard)450.90282.00450.9

34、0414.80450.90414.8020 154氟虫腈亚砜(Fipronil-sufide)418.90261.80418.90383.10418.90383.1020 153.3试验方法3.3.1单一农药标准品配制 将上述4种农药标准品全部取出，分别滴入10mL的容量瓶中，用甲醇做溶剂，定容至刻度线，摇匀，逐一配制成100ugmL-1的单一农药标准储备液，再装入玻璃小瓶中，贴好标签，放置与冰箱中储存。在使用前，将储备液拿出到温度与室温相近，再由之前相关的数据算出应吸取的标液的量加入到样品中。3.3.2 实验流程 准确称取12.5g样品置于离心管，并准确加入25mL乙腈高速匀浆2min后，加

35、入4g氯化钠，将其置于摇床上振摇30min，让试剂有充分的时间混合。把振摇过后的样品（添加乙腈为提取溶液的）放入离心机进行离心（转速8000rmin-1,时间2min），离心后使用移液管分别各取三份，每份5mL，取编号1、2、3。将取得样品置于80水浴氮气或者空气流蒸干。在1号试管中加入2mL的丙酮，并将试管置于振荡器上充分振荡混合，然后定容至5mL。把获得溶液用0.2m滤膜处过滤处理，最后使用GC-FPD检测得出结果。在2号试管中加入2mL正己烷，并将试管置于振荡器上充分混合，使用LC-Florisil柱进行净化处理。净化处理先依次添加5mL丙酮+正己烷（1:9），5mL正己烷预淋，后加5m

36、L丙酮+正己烷（1:9）淋洗（重复一次）。把获得的样品使用50水浴氮吹蒸干。蒸干后往试管内滴加1.25mL 5mmolL-1 乙酸铵溶液，并将试管置于振荡器上充分振荡混合后，用0.2m滤膜过滤后获得滤液，使用UPLC-MSMS检测。在3号试管中加入2mL甲醇+二氯甲烷（5:95)溶液，并将试管置于振荡器上充分振荡混合，使用LCNH2柱进行净化处理。净化处理先使用4mL甲醇+二氯甲烷（5:95）预淋，后加入2mL甲醇+二氯甲烷（1：99）淋洗，重复一次。把获得的样品使用50水浴氮吹蒸干。蒸干后往试管内滴加1.25mL 5mmolL-1 乙酸铵溶液，并将试管置于振荡器上充分振荡混合后，用0.2m滤

37、膜过滤后获得滤液，使用UPLC-MS/MS检测。图3-1 实验流程图 3.4本章小结本章主要介绍了实验过程中用到的仪器以及试剂，并记录了实验中各类仪器需要的参数，最后描述了实验的流程与步骤。第4章 结果与分析4.1提取试剂的选择乙酸乙酯对于蔬菜、水果当中的叶绿素、叶黄素等基质杂质的溶出会比较多，很容易干扰到准确的分析，并且会使仪器设备受到污染；正己烷作为提取试剂来提取的时候，就发现正己烷会使氨基甲酸酯类农药的状态变得不稳定，从而使分析的结果的准确性大大降低；乙腈作为提取溶剂时，其基质溶出很少，不但不会影响样品中目标物质的稳定性，而且更加方便进行样品的净化处理，实验操作简便，而且其回收率高达80

38、%以上，能够很好的满足现今农药残留的检测要求；且鉴于氟虫腈分子结构中含有较多数量的极性原子,且氟虫腈分子具有腈分子的结构,根据相似相溶原理并且综合各方面的考虑，选取乙腈作为最佳的样品提取溶剂。4.2固相萃取柱选择4.2.1固相萃取柱概述固相萃取柱是参考层析柱而逐渐发展起来的的一种样品前处理装置，其用于样品的萃取、浓缩、分离。常用的固相萃取柱基本都会以聚乙烯作为材料的注射针筒类型的装置，这种装置当中装有玻璃纤维或者聚丙烯材料的塞片，并且装填了一定量的色谱吸收剂（填料）在两个塞片中间。4.2.2固相萃取柱的种类固相萃取柱的分离性能取决于其填料，在根据待检测的样品的种类以及它的物化性质而选择适当的填

39、料。固相萃取柱的填料大多是色谱吸收剂，并且可以笼统的分为三大类，分别是高聚物、硅胶、无机材料为基质。以硅胶为基质的固相萃取柱此类固相萃取柱如：Waters Sep-Pak C18固相萃取柱，因为硅胶的极性较强，并且称弱酸性，所以可以被使用于正相以及反相这两种不同的分离模式：因在正相提取中，极性要比硅胶弱，而在反相提取时非极性又比C18或者C8的弱，固对于类固醇等有着比较良好的萃取效果，基本用于弱极性或者非极性的化合物的萃取或者是去除极性的杂质。以高聚物为基质的固相萃取柱此类固相萃取柱如：聚苯乙烯-二乙烯苯等。高纯度的苯乙烯-二乙烯基笨聚合物作为萃取柱的固定相填装，其具有高载样量并且可耐受极端p

40、H条件的不同溶剂。所以其可用于作为酸性、碱性和中性化合物的吸附剂，并且大部分情况下用在反相条件下，并且保留含有亲水基团的疏水性化合物，例如：酚类、硝胺类、硝酸酯类以及硝基芳香类等等。以无机材料为主的固相萃取柱这类固相萃取柱有：弗罗里硅藻土、石墨化碳、氧化铝等。而弗罗里硅土是一种极性的硅胶吸附剂，其由氧化镁复合而成，用这种作为萃取柱的基质比较适合用于从非极性基质当中吸附各种极性化合物，例如：多环芳烃、多氯联苯、有机氯农残等等；石墨化碳黑萃取柱是一种以石墨化碳黑为填料的萃取柱，这种萃取柱的萃取过程十分的迅速，并且对于化合物的吸附量相比于硅胶大了足足一倍多，而由于石墨化碳黑的表面有正六元环的结构，使

41、得其对于平面分子具有极强的亲和力，十分适用在很多有机物的净化与萃取当中，尤其是适用于去除、分离各种基质譬如蔬菜水果中的色素、甾醇、苯酚等物质；还有以氧化铝作为基质的填料分别有酸、中性、碱三种类型，适用于这三性溶剂的分离萃取。4.2.3各种固相萃取柱的净化效果与选择表4-1比较各种固相萃取柱的净化效果表色素氟虫腈及代谢物回收率/%C18不好80120GCB(石墨)很好5075Flotisil(硅酸镁)稍好80120NH2好6595PSA好7095根据表4-1的数据显示，Flotisil（硅酸镁）的整体回收率高达80120%，相对于其他几种萃取柱，有明显的优势。而C12萃取柱的整体回收率也高达80

42、120%，但是比较其色素的去除效果FLotisil（硅酸镁）确更加有优势。C18萃取柱一般用来极性溶剂，或去除脂肪、叶绿素等。并且因为本提取剂选择了乙腈溶液，C18萃取柱对于在用乙腈为提取剂的时候都是不保留的。而GCB（石墨）萃取柱对平面分子具有极强的亲和力，非常的适合应用于非常多的有机物的萃取以及净化，特别是用于分离或去除各种蔬菜水果中色素，因其对于氟虫腈及代谢物的回收率不高，固不选择。NH2萃取柱是在高纯硅胶基质上键合极性键合相氨基丙基的极性吸附剂，而且同时具有氢键和阴离子交换两种作用机理，可用于从极性样品当中分离其非极性分化合物。PSA萃取柱是与NH2萃取柱相似的萃取柱，主要还是去除样品

43、中的有机酸、色素、金属离子和酚类等。而Flotisil（硅酸镁）萃取柱整体回收率高，并且萃取过后的杂质较少，所用的试剂相对来说毒性较少，减少对人体、环境的危害。4.3氮吹温度的选择表4-2 氮吹温度对几种农药回收率的影响氮吹温度/ 6070707575以上氟虫腈氟甲腈氟甲腈砜氟甲腈亚砜氟虫腈氟甲腈氟甲腈砜氟甲腈亚砜氟虫腈氟甲腈氟甲腈砜氟甲腈亚砜回收率/%899294837265807860425148 根据表4-2所示，在不同的氮吹温度对于实验所研究的四种农药（氟虫腈、氟甲腈、氟甲腈砜、氟甲腈亚砜）的回收率有着明显的差异。其中在氮吹温度为6070时，回收率比较高，而在75以上，回收率显著降低。

44、因氟虫腈及其代谢物都属于有机磷农药，有机磷农药挥发性较强并且在自然环境中不稳定，在高温的氮吹条件下，可导致其挥发或分解，固影响到氟虫腈及其代谢物的回收率。根据多种数据，控制氮吹时的温度对于氟虫腈及其代谢物的回收至关重要。经在不同氮吹温度下的实验，选定使用最佳氮吹温度为6070作为实验条件。4.4提取方式的选择表4-3三种提取方式的回收率提取方式匀浆2min超声15min振摇30min回收率/%70110 80120 701104.4.1超声波提取法的原理及其优缺点超声波提取法是利用超声波特殊的物理性质从而达到萃取、分离的一种比较广泛使用的前处理方法。其原理是：利用其产生的空化效应（由于液体微粒

45、剧烈的震动从而在内部产生的小空洞并随即破灭）来加大农药溶出的速率，从而有效地加快物质扩散，使得提取时间变得更加短。目前超声波辅助提取在农药残留的分析中有着广泛的应用。优点：操作简单，快速、成本低、提取效率高缺点：使用时产生的噪音比较大，超声过程中若样品分布不均可能导致重现性差、回收率低等问题。4.4.2匀浆提取法的原理及其优缺点匀浆提取法原理：借助高速电机带动转子高速地旋转，促使转子做高速圆周运动，产生高频的线速度以及角速度，在定子与转子的狭窄空隙中通过反复磨搽、挤压、碰撞使料液乳化、分散、均匀混合。均质的效果比普通搅拌要高1000倍。优点：操作简单、方便；均质时间短，节省时间；提取效率高，目

46、前在农药残留分析的样品前处理中有非常广泛的应用。缺点：由于转子清洗难度较大，若清洗不当，再次使用容易导致增加杂质并引起交叉污染。4.4.3振摇提取法的原理及其优缺点振摇提取法是利用摇床的规律运动使容器中的物质充分混合优点：操作简单方便，成本低，效果稳定。缺点：操作时间有点长。本实验选择使用振摇30min为提取方法，因为超声波提取法容易导致温度升高，而氟虫腈及其代谢物具有较强挥发性和不稳定性，影响回收率。而匀浆提取法会产生交叉污染。则选取最佳提取方法为较为稳定的振摇30min。4.5纯混标与基质标（柑橘、番茄、菜心）峰面积的比较优化原处理的方法，寻找一种新的具有高准确度、精确度、灵敏度并且操作方

47、便的新方法，同时可以研究蔬菜中农药残留的基质效应，明确基质效应的作用结果，可以在以后气相色谱检测分析中同等程度地补偿标液和样液中农药的响应，以解决基质效应带来的问题，保证检测数据准确、可靠。4-4 纯混标与基质标峰面积比较峰面积 氟虫腈氟甲腈氟虫腈砜氟虫腈亚砜纯标71867134938786581394柑橘54812101966888562581番茄56615107697207863911菜心5580196706368955535表4-5样品中的四种农药的基质效应氟虫腈砜氟虫腈氟虫腈亚砜氟甲腈菜心72.49%77.64%68.23%71.67%柑橘78.40%76.27%76.89%75.57

48、%番茄82.03%78.78%78.52%79.81% 目的基质效应的值可以通过下面的公式计算，即样品基质中待测物的峰面积与纯溶液中待测物峰面积的比值： 基质效应在农残分析当中是非常普遍存在的现象，并且农药受到样品的基质效应因素影响，而这种效应在液质当中有着抑制离子化过程的影响，从而导致了分析的准确性，所以在这种方法分别有流动相和空白样品溶液稀释的一系列标准溶液，进行LC-MS/MS对比来检测，而分析的结果证明四种氟虫腈在离子化的过程中有细微的信号减少，而在相应的样品检测中，采用了空白基质提取液配制标样来取消基质效应。不同的蔬菜基质所产生的基质效应大小都不一样，所以在有机磷的检测时要测定不同的

49、蔬菜，要选择对应的蔬菜基质来做标液。在通过该实验的过程中，发现基质效应普遍存在。因此在日常的例行检测中，最好是能够对蔬菜进行分类检测，即对每类蔬菜做一个基质标样，减少由于不同基质从而产生的干扰，确保检测结果的准确性。4.5色谱条件优化分别选择乙腈和甲醇作为强洗脱流动相。当使用甲醇铵作为流动相的时候，在相同的条件下，离子化将受到不同程度的抑制，响应值将会明显的降低，导致了灵敏度的下降，而使用乙腈作为流动相时，离子化效率明显是要优于甲醇的，所以本实验采用乙腈最为强洗脱流动相。在流动相中加入甲酸和乙乙酸铵能够明显地增加化合物在ESI-模式下的离子化效率。图4-1是阴性样品添加了4种氟虫腈及其代谢物的

50、多反应检测MRM色谱图。 图4-1加标样品的多反应检测色谱图4.6质谱条件的优化本实验以氟虫腈类的标准溶液在质谱ESI-上扫描，选出信号相对较强的两个碎片离子与其母离子分别组成两对监测离子对，在UPLC-MS/MS仪器的MRM模式下，实施对于锥孔电压与碰撞能量等参数的进一步优化，而对于离子来说，一般的驻留时间有0.05s，所以对于响应得比较弱的离子，其取值可以适当地增加。其中有要注意的事就是尽可能的避免选择与分子离子峰质量数相差18的脱水碎片离子。优化过后得到的MRM离子对和质谱条件如表3-5，其定性分析标准为保留时间和各对离子的响应强度比例，使得这个方法拥有更强的专属性，并且有效地避免了来自

51、杂质的干扰。4.7方法验证4.7.1线性范围和检出限 在优化实验的条件下，利用阴性样品做出空白基质，降低减少基质效应对于实验结果的影响，配制质量浓度分别为：5gL-1、10gL-1、20gL-1、40gL-1、80gL-1、100gL-1、150gL-1的标准溶液，选择进样量为5L去进行液相色谱的分析，并且以分析出来的峰面积（Y）对浓度（x，gL-1）作线性回归，作出线性回归方程，如表4-6。其中，线性的相关系数为：R20.992。作出线性回归方程后，根据所作出的7个空白的样品的基线的噪音值N从而求出其平均值，如果按照信噪比= 3 ，则可以依次计算出检出限（LOD） 0.5gkg -1；而定量

52、限（LOQ） 1.5gkg-1。 检出限（LOD）计算方法： 公式： （4-1） （4-2） （4-3） 式中：N为检测器的噪音响应值 S为检测器的灵敏度 k为线性方程的斜率表4-6 在混标中四种氟虫腈类的线性方程、相关系数、检出限、和定量限组分 线性方程相关系数检出限/gkg-1定量限/gkg-1氟虫腈Y=9.29767X+26.5312R=0.9950.0320.1氟甲腈Y=3.55433X+1.7463R=0.9920.501.5氟虫腈砜Y=27.0399X+74.519R=0.9960.0390.1氟虫腈亚砜Y=19.2142X+73.0679R=0.9980.0610.2结论：由数据而得氟虫腈的检出限为0.032gkg-1,氟甲腈检出限为0.50gkg-1，氟虫腈砜检出限为0.039gkg-1，氟虫腈亚砜检出限为0.061