肠出血性大肠杆菌O104H4检测技术课件

1、肠出血性大肠杆菌EHEC O104:H4检测技术海淀疾病预防控制中心微生物检验科 2012年3月26日肠出血性大肠杆菌正常菌群，一般不致病条件致病某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染。可引起腹泻的大肠杆菌称为肠道致病性大肠杆菌或致泻性大肠杆菌。细菌居住部位改变引起的肠外感染：尿路感染最常见致病菌株大肠杆菌正常菌群，一般不致病条件致病某些带有致病基因的血清型，引起肠H抗原(鞭毛)O抗原(LPS侧链)K抗原(荚膜)F抗原(菌毛)复杂的抗原构造H抗原O抗原K抗原F抗原复杂的抗原构造肠道致病性大肠杆菌分类目前根据毒力因子、致病机理和流行病学特征，通常将肠道致病型大肠杆菌分为5 类：肠致病性大肠杆菌（

2、EPEC）肠产毒性大肠杆菌（ETEC）肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）肠集聚性大肠杆菌（EAEC）肠出血性大肠杆菌（EHEC）肠道致病性大肠杆菌分类目前根据毒力因子、致病机理和流行病学菌株EPECETEC作用部位小肠小肠所致疾病婴儿腹泻旅行者腹泻婴幼儿腹泻致病机理粘附和破坏上皮细胞肠毒素EIECEAECEHEC大肠小肠大肠较大儿童或成人痢疾样腹泻急慢性腹泻出血性结肠炎侵袭和破坏结肠粘膜上皮细胞集聚性粘附上皮细胞志贺毒素肠道致病性大肠杆菌引起的腹泻菌株作用部位所致疾病婴幼儿腹泻致病机理EIEC大肠较大儿童或肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli, EPE

3、C）致病机制：LEE毒力岛和EAF质粒（编码束状菌毛）病原菌在十二指肠、空肠和回肠上段粘膜表面大量繁殖，粘附于微绒毛，导致刷状缘被破坏、微绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功能受损 （A/E损伤），造成严重腹泻。肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Esch肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）典型EPEC（含有LEE 和70100kb 的大毒力质粒EAF）是发展中国家引起婴幼儿特别是06个月婴儿腹泻的主要病原菌，在某些发展中国家EPEC引起的婴儿腹泻可达3040%。上世纪4050年代之前，EPEC常引起发达国家婴幼儿腹泻的暴

4、发；非典型EPEC（含有LEE但不含毒力质粒EAF）是发达国家引起腹泻的重要病原菌，并能引起发达国家婴幼儿和成人的腹泻暴发。非典型EPEC感染引起的腹泻通常持续时间更长，可超过14天。典型EPEC的储存宿主主要是人，而非典型EPEC人和动物都可作为储存宿主。肠致病性大肠杆菌（Enteropathogenic Esch肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）致病机制：肠毒素和定植因子肠毒素有不耐热肠毒素（heat labile enterotoxin, LT）和耐热肠毒素（heat stable enterotoxin, ST）两种。LT与

5、腺苷环化酶作用，使胞内cAMP水平增高，导致肠粘膜细胞内水、钠、氯等过度分泌至肠腔，导致腹泻；而ST通过激活肠粘膜细胞上的鸟苷环化酶，使胞内cGMP升高而导致腹泻。肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Esche肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinvasive Escherichia coli, EIEC）致病机制：侵袭性大质粒与志贺菌相似。细菌经消化道进入大肠后，穿过粘液层，粘附到肠上皮细胞上，引起细胞内吞，被带入细胞内空泡中。其毒力主要表现在能使空泡破坏，细菌进入上皮细胞胞浆中增殖，最后杀死细胞，再扩散到邻近细胞，导致组织破坏和随后的炎症发生。肠侵袭性大肠杆菌（Enteroinv

6、asive Escher肠集聚性大肠杆菌（Enteroaggregative Escherichia coli, EAEC）致病机制：毒素和粘附素毒 素 包 括 肠 集 聚 耐 热 毒 素 （ enteroaggregative heat-stabletoxin, EAST）和不耐热毒素（plasmid encoding toxin，Pet），可导致大量液体分泌。细菌通过集聚性粘附菌毛粘附于肠粘膜上皮细胞，在细胞表面聚集，形成砖状排列。肠集聚性大肠杆菌（Enteroaggregative Esc肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）

7、致病机制：志贺毒素和LEE毒力岛EHEC产生的毒素能使vero细胞产生病变，故称vero毒素；又因与志贺菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦 称 志 贺 样 毒 素 （ shiga-like toxin ， SLT ） 或 志 贺 毒 素 Stx ；EHEC的Stx分两型，Stx1与痢疾志贺菌的ST基本相同，可被抗志贺菌抗毒素中和。Stx2则与ST有60%的同源，Stx2目前发现有多种亚种。两型毒素均由溶原性噬菌体介导。肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Esc肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）

8、O157:H7 是EHEC 的主要血清型，此外还包括O26 、O111 、O103、O113、O117、O128等四十多个血清型。由EHEC O157:H7引起的大暴发：1982年美国首次报道大肠杆菌O157:H7引起出血性肠炎。1996年日本报告一起学校儿童的暴发疫情，病例7470例，住院病例近千例，有约100病例并发HUS，死亡3例。1999年我国苏皖等地发生了大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，估计2万人感染，195例HUS，死亡177人。2006年美国暴发一起由污染的包装菠菜造成的暴发，具有高的住院率（50%）和HUS（16%）。肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic

9、 Esc肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）临床表现：EHEC O157:H7感染的潜伏期是34天，但在某些暴发中可以长达58天或短至12天。我国暴发流行的地区最短潜伏期为8小时，平均为15天。临床表现主要有：腹部绞痛和轻度腹泻，一些病例为血性腹泻（出血性肠炎）。多数病人10天内康复，少数病人特别是幼儿和老年人，可出现严重并发症，如以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血尿毒综合症（HUS）。一般5%10%的EHEC感染者可发展为溶血尿毒综合症，病例死亡率为3%至5%。肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagi

10、c Esc肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）STEC， Shiga toxin- producing Escherichia coli人们把产生志贺毒素的大肠杆菌统称为STEC 。相对来说，STEC 的 范 围 大 一 些 , EHEC 覆 盖 的 范 围 小 一 些 。 STEC 包 括EHEC, EHEC只是STEC的一部分。并不是所有的产Stx毒素的大肠杆菌都能引起出血性肠炎或溶血性尿毒综合症。肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic EscEHEC O104:H4德国肠出血性大肠杆菌O104:H4暴发疫情20

11、11 年5 月初，德国暴发了规模较大的肠出血性大肠杆菌疫情，随后波及法国、瑞典、美国、加拿大等16个国家。据世界卫生组织(WHO)报道，自2011 年5月1 日至7 月7 日共计报告3941 例EHEC O104:H4 感染病例，死亡48 例，其中909 例发生溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome, HUS)，死亡36例；肠出血性大肠杆菌肠炎3032 例，死亡16 例。是德国迄今最严重的一次EHEC 疫情， 也是世界范围内造成HUS 重症病例最多的一次致病大肠杆菌暴发。EHEC O104:H4德国肠出血性大肠杆菌O104:H4暴EHEC O104:H4德国肠出血

12、性大肠杆菌O104:H4暴发疫情临床特点：HUS发生率（510%）死亡率（35%）年龄：89% (HUS) 为20岁以上成年人88% (EHEC)（WHO，6月6日）性别：70% (HUS) 为女性62% (EHEC)（WHO，6月6日）感染来源：黄瓜、西红柿、豆芽？EHEC O104:H4德国肠出血性大肠杆菌O104:H4暴EHEC O104:H4感染流行大事记（2011）5月15日，德国一位83岁妇女，因血样便腹泻就诊。5月21日，德国15日因血样便腹泻就诊的83岁妇女死亡，实验室检查确诊为感染大肠杆菌。5月25日，德国EHEC参考实验室在5例患者粪便样本中，发现EHEC的血清型为O104

13、。5月26日，德国怀疑受感染的蔬菜来自西班牙5月31日，德国卫生官员公布了实验室初步检测结果，称西班牙黄瓜未检出引发“毒蔬菜”事件的EHEC菌株，德国当局宣布拓宽EHEC污染源警示。西班牙境内的瓜果类蔬菜价格一落千丈,正考虑对德国的错误警告采取法律行动。EHEC O104:H4感染流行大事记（2011）5月15日EHEC O104:H4感染流行大事记（2011）6月5日，德国怀疑下萨克森州芽苗菜是肠病疫情传染源。6月6日，德国下萨克森州农业部宣布，对被疑是本次EHEC疫情传染源的芽苗菜的初步抽样检查，并没有发现致病菌。6月10日，德国国家疾病控制中心罗伯特科赫研究所等多家机构在柏林表示，他们发

14、现，这些顾客中感染EHEC的患者都吃了带有生芽苗菜的食物，食用芽苗菜者患病的几率是未食用者的9倍。他们已确认豆芽等芽苗菜是造成此次EHEC疫情的源头。EHEC O104:H4感染流行大事记（2011）6月5日，EHEC O104:H4感染流行大事记（2011）7月4日，德国表示各种流行病学的统计参数显示，历时近两个月的德国EHEC疫情目前已接近尾声。这是德国迄今最严重的一次EHEC疫情，也是世界范围内造成HUS重症病例最多的一次致病大肠杆菌暴发。EHEC O104:H4感染流行大事记（2011）EHEC O104:H4德国肠出血性大肠杆菌O104:H4暴发疫情菌株特点（Robert Koch

15、Institute）：血清型O104:H4Shigatoxin 1: -Shigatoxin 2 (vtx2a) : +Intimin (eae) : -Enterohemolysin : -aatA-PCR:aggR-PCR:+aap-PCR:aggA-PCR:aggC-PCR:+EHECEAECenteroaggregative Verocytotoxin-producingE. coli (EAggEC VTEC) O104:H4EHEC O104:H4Shigatoxin 2 (EHEC O104:H4检测技术流程不同种类标本增菌6小时*PCR 检 测 eaeA 、 ehxA 、agg

16、R、wzy、fliC基因*细菌分离培养可疑菌落革兰染色系统生化鉴定血清型鉴定毒力基因检测分子分型结果判定和上报提取核酸PCR检测stx1和stx2基因stx1和/或stx2阳性EHEC O104:H4检测技术流程不同种类标本增菌6小时*肠出血性大肠杆菌O104:H4病例定义1. 疑似病例。发病前10天内曾在EHEC O104:H4流行地区旅行或居住，或者发病前10天内与临床诊断/确诊病例有密切接触，且符合下列条件之一者：（1）有血性腹泻或腹部痉挛性疼痛等症状，无实验室证据诊断为其他非EHEC O104:H4感染者；（2）有微血管病性溶血性贫血（外周血涂片破碎红细胞2）、血小板减少、肾脏受累（血

17、尿、蛋白尿、急性肾损伤）等HUS临床表现者。2. 确诊病例。疑似病例具备下列二项之一者:（1）从粪便标本中分离到EHEC O104:H4菌株, stx1和/或stx2基因检测阳性；（2）从粪便标本中检测到stx1和/或stx2基因阳性，同时aggR、wzy(O104)和fliC (H4)基因检测全部阳性。肠出血性大肠杆菌O104:H4病例定义1. 疑似病例。发病前毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法1、stx1slt-1-a：slt-1-b:5-CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG-35-CACCAGACAATGTAACCGCTG-3PCR反应体系(20l)：2l1l1l1l0.2l1

18、l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )slt-1-a引物 (10M)slt-1-b引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反应条件：94 3min94 30sec60 30sec 30循环72 45sec72 5minMstx12000bp1000bp750bp500bp250bp100bp348bp毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法slt-1-a：5-毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法2、stx2slt-2-a：slt-2-b:5-ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG-35-GCGTCATCGTATAC

19、ACAGGAGC-3PCR反应体系(20l)：2l1l1l1l0.2l1l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )slt-2-a引物 (10M)slt-2-b引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反应条件：94 3min94 30sec56 30sec 30循环72 45sec72 5minMstx22000bp1000bp750bp500bp250bp100bp589bp毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法slt-2-a：5-毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法3、eaeAeaeA-a：eaeA-b:5-ATTACC

20、ATCCACACAGACGGT-35-ACAGCGTGGTTGGATCAACCT-3PCR反应体系(20l)：2l1l1l1l0.2l1l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )eaeA-a 引物 (10M)eaeA-b 引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反应条件：94 3min94 30sec56 30sec 30循环72 45sec72 5minMeaeA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp397bp毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法eaeA-a：5-A毒力基因/抗原特异性基因PCR

21、检测方法4、ehxAMFS-1Fb：MFS-1R：5-CCAGGAGAAGAAGTTAGAG -35-CTTCACGTCACCATACATAT-3PCR反应体系(20l)：2l1l1l1l0.2l1l13.8l10PCR Buffer (含Mg2+ )MFS-1Fb 引物 (10M)MFS-1R 引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2OPCR反应条件：94 3min94 30sec56 30sec 30循环72 45sec72 5minMehxA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp369bp毒力基因/抗原特异性基因

22、PCR检测方法MFS-1Fb：5-毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法5、aggRaggR-F：aggR-R:5-GTATACACAAAAGAAGGAAGC-35-ACAGAATCGTCAGCATCAGC-3PCR反应体系(20l)：10PCR Buffer (含Mg2+ )aggR-F 引物 (10M)aggR-R引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)2l1l1l1l0.2l1l13.8lDNA模板dH2OPCR反应条件：94 3min94 30sec56 30sec 30循环72 45sec72 5minMaggR2000bp1000bp750bp50

23、0bp250bp100bp254bp毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法aggR-F：5-G毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法6、aatAaatA-F： 5-TATATTGAAATGCTTAGTGAGAG -3aatA-R:5-CTGATACCCAGACTAGCACT-3PCR反应体系(20l)：10PCR Buffer (含Mg2+ )aatA-F 引物 (10M)aatA-R引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2O2l1l1l1l0.2l1l13.8lPCR反应条件：94 3min94 30sec56 30sec 30循环72 45

24、sec72 5minMaatA2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp510bp毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法aatA-R:5-C毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法7、aapaap-F：5-ATGAAAAAAATTAA GTTTGTTATCTT-3aap-R： 5-TTATTTAACCCATTCG GTTAGAGC-3PCR反应体系(20l)：10PCR Buffer (含Mg2+ )aap-F 引物 (10M)aap-R引物 (10M)dNTPs (10mM)Taq DNA聚合酶 (5U/l)DNA模板dH2O2l1l1l1l0.2l1l13.8lPCR反应条件：94 3min94 30sec56 30sec 30循环72 45sec72 5minMaap2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp356bp毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法aap-F：5-AT毒力基因/抗原特异性基因PCR检测方法8、wzywzy-F：wzy-R:5-AGTTCATTAGATCGAGGTT-35-CTCCTTGCAAATGTGCAA-3PCR反应体系(20l)：10PCR Buffer