质粒构建步骤设计

1、ALS相关基因蛋白表达载体的构建材料：含有GST载体pGEX-6p-1的菌（约5kb）； SMNld （大约1kb）和C9ORF72 （大 约 1.5kb）基因；BamH1 和 EcoR1 酶 Cutsmart。步骤：目的基因的获得1、引物设计SMNld TRANSCRIPTION-BGGATatggcgatgagcagcggc 27b75.17Csmnld TRANSCRIPTION-gGAATTTAATTTAAGGAATGTGA27b59.09CC9ORF72 FGTGGATATGTCGACTCTTTGCCCA27b66.98CC9ORF72 RGCGAATttaaaaagtcattaga

2、ac33btcg63.44C2、将含有目的基因的质粒进行PCR.（ ul）编号模板复合物引物F/RddH2O目的基因模板浓度12102210SMN未稀释2010221032102210C9ORF72未稀释4010221050.2102210SMN1/10060.5102210SMN1/10070.2102210C9ORF721/10080.5102210C9ORF721/1003、DNA电泳（1g琼脂糖/100m1XlTAE）以检测PCR产物。0 1 2 3 4 5 6 7 84、跑胶并回收5号和6号（SMN）共40u l全部加到一号孔中7号和8号（C9ORF72）共40ul全部加到三号孔中五

3、号孔加5 u lMarker回收:1、在紫外光下将目的带切下，放入两个EP管中2、每管中加 250 ul Binding Buffer, 60C,7 分钟融化3、将溶化后的胶加入到柱子中；10000 xg 1min离心，弃液4、加 300 u IBinding Buffer,10000 xg 1min 离心，弃液5、加700 u 1SPW洗两次，10000 xg 1min离心、，弃液6、12000 xg，2mi口离心，挥干乙醇7、超净台内吹2min8、加 30u1ddH2O 静置 1min，10000 xg 1min 离心、9、重溶解一遍质粒的获得：1、扩大培养：将菌种接种(20 ul)到含有

4、AMP(5 ul)的培养基(5ml)上， 37C摇过夜。2、提质粒：1、收集50-100ml过夜培养的菌液10000rpm离心、1分钟，尽量 吸除上清2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250 u l溶液I，使用移液器 或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。3、向离心、管中加入250 u l溶液II，温和地上下翻转6-8次使菌 体充分裂解。注意：翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。作用时间不要超过2分钟，以免质粒受到破坏。4、向离心、管中加入350 u l溶液III，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。5、20000rpm 离心、10 分钟。6、将上一步所得上清液加入吸

5、附柱中（吸附柱加入收集管中）， 室温放置2-3分钟，10000rpm离心、30-60秒，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。7、向吸附柱中加入500U1HB清洗，10000rpm离心、1分钟，倒 掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。8、向吸附柱重加入700 U1WB，10000rpm离心、1分钟，弃掉收 集管中的废液。9、重复810、将吸附柱放回收集管中，15000rpm离心2分钟，将吸附柱 置于室温放置3-5分钟，挥发乙醇。11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬 空滴加30洗脱液缓冲液或去离子水，室温放置2分钟，10000rpm离 心1分钟将质粒溶液收

6、集到离心管中。12、测浓度或跑胶验证并在-20笆保存。（将1U1的loading与 1U1的质粒混合点样）载体构建1、双酶切目的基因和质粒（单位U1）序号BamHlEcoRlCutsmartSMNC9ORF72p-GEX1223.630002223.603003223.60030每个体系37.6u1，37C水浴4h。2、连接2u1 载体+6u1 目的片段+1U1T4 Buffer+0.5 u 1T4 酶+0.5u1 水 共10u1室温1h四、转化与筛选：将构建好的质粒转入感受态宿主细胞中并接种于含有Amp的培养基中，筛选导入质粒的细胞。1、取感受态大肠杆菌在冰上融化2、将酶连产物全部加入感受态

7、中，混匀，在冰上放置30min3、42C热激90s，马上放在冰上，放置3min4、加750 u 1无抗LB，37C摇床摇45min5、5000 xg离心、4min，弃650 u1上清重悬6、将上述菌液摇匀后取100u1涂布于含Amp的筛选平板上，37C培养箱过夜SMNC9ORF72空白质粒（AMP持续效率只有十七个小时左右，所以不能培养时间过长）五、 目的基因检测1、挑取单菌落接种于含AMP的LB中，37笆摇床扩大培养，过夜2、做PCR或酚氯仿快检重组质粒快检的具体方法快检就是直接用摇起的菌液取100uL,加50uL的苯酚和50uL的氯仿涡旋离心，取上清跑胶，对照上个空载体，3、跑胶并确定目的

8、菌（点样2ul）M 01 2 34 5 67 8 9 10 11 M SMN-PCRM 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 0C9ORF72-快检M C9ORF72-PCRSMN： 2 号C9ORF72： 1 号和 6 SMN： 2 号4、测序，保菌，提质粒。C Q G 心以心 C Q G 心以心 G aGG A 1 CC GT GCTGTT CC GGCG CGGC aCA C GC Ca G AG CGn! UUM.JAU-AT TCT GACaT TTG GG AT G *1 aCA Q CACT G AT aA A A SCAT AT感受态的制备.：接菌到加有5 ml LB培养

9、基的15 ml离心管中扩大培养，37C摇床过夜。将过夜所得到的菌液接种到含250 ml LB的1 L锥形瓶中,37C培养至OD值为0.40.6。用50 ml离心管分装，4C, 4500 g离心10 min,弃上清（此步往下在冰上操作）。用30ml 0.1mol/L的氯化钙轻柔重悬。5.4C, 4500 g 离心 10 min。弃上清，加2ml氯化钙重悬，加甘油（甘油最终浓度为20%）。分装1.5 ml EP管中，每个50 UL，-80C储藏。转染转染前一天，在不包含抗生素的适量的培养基中接种细胞，转染时细胞的 汇合度要达到70 - 90 %。准备复合物：100闫不包含血清的Opti-MEM培养基+mg质粒；100M不包含血清的Opti-MEM 培养基+5M Lipofectamine，孵育五分钟；轻轻混匀后在室温下再孵育15分 钟。将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养 板混合。37 C，CO2培养箱孵育，在转