基因克隆医学知识培训课件

1、基因克隆医学知识基因克隆医学知识基 因 克 隆 Gene Cloning基因克隆医学知识2基 因 克 隆基因克隆医学知识2概述克隆载体受体细胞体外重组的策略基因克隆工作流程基因克隆医学知识3概述基因克隆医学知识3一、概述确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码基因克隆医学知识4一、概述确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合DNA杂合子转化入大肠杆菌所需元件： 限制性内切酶 连接酶 载体 受体细胞基因克隆医学知识5

2、1973年Cohen完成第一个基因工程实验经体外重组获得杂合基因克隆（分子克隆molecular cloning）-通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。基因克隆医学知识6基因克隆（分子克隆molecular cloning）-基因克隆的核心-体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 基因克隆医学知识7基因克隆的核心-体外重组(Recombination基因克隆的技术路线 目的基因 载体体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛选阳性克隆大量扩增，获得子代DNA基因克隆医学知识8基因克

3、隆的技术路线体外重组重组子（杂合DNA）转化受体细胞筛基因克隆医学知识9基因克隆医学知识9二、克隆载体复制基因(replicator)选择性记号克隆位点基因克隆医学知识10二、克隆载体复制基因(replicator)基因克隆医学知识三、受体细胞1、定义：外源DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。2、要求：易于接纳外源DNA 无特异的内源性核酸内切酶 载体复制、扩增不受阻 与载体有互补性基因克隆医学知识11三、受体细胞基因克隆医学知识11四、体外重组的策略1、粘末端连接1）全同源粘末端连接 最方便简单 高背景-载体自身环化 双向插入基因克隆医学知识12四、体外重组的策略基因克隆医学知识122）定

4、向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略粘-粘连接：最有效、最快捷粘-平连接：适用于外源基因仅与载体有一个相同酶切位点，可将另一末端补平基因克隆医学知识132）定向克隆：使外源基因定向插入到载体中的克隆策略基因克隆医2、平末端连接：酶切点为平末端或任何两个末端补平的DNA效率低，酶用量大基因克隆医学知识142、平末端连接：基因克隆医学知识143、人工接头连接人工接头：人工合成含有酶切位点的寡核苷酸片段基因克隆医学知识153、人工接头连接基因克隆医学知识154、T-A克隆T-vector两条链的5端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A基因克隆医学知识164、T

5、-A克隆基因克隆医学知识16五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的获得1、直接分离3、构建cDNA文库4、PCR5、人工合成6、差异显示基因克隆医学知识17五、基因克隆的工作流程基因克隆医学知识171、直接分离DNA适用于克隆原核生物的基因组文库基因克隆医学知识181、直接分离DNA适用于克隆原核生物的基因组文库基因克隆医2、构建基因组文库，筛选目的基因基因组文库(gene library)：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞，进行克隆。这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库，它包含了该生物的所有基因。基因克隆医学知识192、构

6、建基因组文库，筛选目的基因基因克隆医学知识19构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）基因克隆医学知识20构建流程抽提基因组DNA鸟枪法制备DNA片段DNA片段与载体特点及应用：包含所有遗传信息构建难度大（单拷贝基因、长片段基因）筛选难度大用于研究基因在基因组中的情况基因克隆医学知识21特点及应用：基因克隆医学知识213、构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞

7、克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。基因克隆医学知识223、构建cDNA文库，筛选目的基因基因克隆医学知识22cDNA文库仅包含正在表达的基因不同物种、不同组织的cDNA文库不相同基因总量少，易筛选基因克隆医学知识23cDNA文库仅包含正在表达的基因基因克隆医学知识234、PCR扩增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因以基因组DNA为模板，直接进行PCR扩增较难多采用以mRNA为模板的RT-PCR法基因克隆医学知识244、PCR扩增目的基因片段基因克隆医学知识245、人工合成较短的DNA6、差异显示法(differential display, DD)筛选差异表达的基因基因

8、克隆医学知识255、人工合成较短的DNA基因克隆医学知识25（二）体外重组连接体系的建立：温度：粘末端连接：12-18 平末端连接：室温（低于30)DNA量：载体分子数/目的基因分子数=1：1-3酶量：平端连接时需加大酶量基因克隆医学知识26（二）体外重组基因克隆医学知识26（三）转化Cacl2法、电击法（四）重组子的筛选及鉴定1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑） 原位杂交2、鉴定：长度鉴定：酶切、PCR方向鉴定：联合酶切测序基因克隆医学知识27（三）转化Cacl2法、电击法基因克隆医学知识27基因的表达 Gene Expression基因克隆医学知识28基因的表达基因克隆医学知识28一表达系统

9、： 基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。 基因克隆医学知识29一表达系统：基因克隆医学知识29基因克隆医学知识30基因克隆医学知识30据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统： 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达的体系。基因克隆医学知识31据受体细胞的不同可分为：基因克隆医学知识31二原核生物基因结构和表达特点基因克隆医学知识32二原核生物基因结构和表达特点基因克隆医学知识32原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。 原核生物形成

10、多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。 基因克隆医学知识33原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统 4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。基因克隆医学知识343、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位 基因克隆医学知识35基因克隆医学知识35原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。包括：调控区(调节基因，启动基因， 操作基

11、因)、 结构基因基因克隆医学知识36原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。基因克隆医学知5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子终止子 基因克隆医学知识375、原核生物中参与转录的基因结构：基因克隆医学知识37启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。 一般长40-60bp，富含A-T碱基对具有保守序列： -10区（pribnow box）：TATAAT -35区： 基因克隆医学知识38启动子(promoter, P)是指能被RNA聚合酶识别、结RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录各种启动子启动转录能力不同。启动子强弱取决于-

12、35区和-10区的碱基组成及其间隔序列 基因克隆医学知识39RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不开始转录基因克隆医学知识终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 基因克隆医学知识40终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RN6、与转译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点转译起始密码子AUG 或GUGSD顺序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11 bp长约3-9bpmRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列 基因克隆医学知识416、与转译有关的原核细胞结构：核糖体结合位点基因克隆医学三外源基因在原核表达系统中表达的必

13、要条件：删除内含子和5非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解 基因克隆医学知识42三外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：基因克隆医学知识四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。 基因克隆医学知识43四影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：基因克隆医学知识常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac :Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受噬菌体CI基因

14、负调控。温度诱导。 基因克隆医学知识44常见原核强启动子：基因克隆医学知识442、基因剂量：3、核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3末端互补程度。AUGSD间距离。AUG后的核苷酸 基因克隆医学知识452、基因剂量：基因克隆医学知识45五原核表达载体： 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子 SD顺序 筛选标志 其它调控基因 基因克隆医学知识46五原核表达载体： 适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。类型：融合型表达载体：-融合蛋白非融合型表达载体：-天然完整蛋白分泌型表达载体：-产物可跨膜分泌至胞周间隙 基因克隆医学知识47类型：基因克隆医学知识47（一）融合型表达载

15、体 PSDForeign DNA融合型表达载体融合基因基因克隆医学知识48（一）融合型表达载体 PSDForeign DNA融合型表达技术关键：克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点加人工合成的DNA接头构建位相载体基因克隆医学知识49技术关键：克隆基因插入原核序列3端而维持正确阅读框架。基因-ATG - AAC CTG GAA TTC CTA GGT -TAC -TTG GAC CTT AAG GAT CCA-EcoRIBamHIAAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGTTTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA 载体部分序列DN

16、A序列基因克隆医学知识50-ATG - AAC CTG GAA TTC C位相载体-含有3种读码框的系列载体基因克隆医学知识51位相载体-含有3种读码框的系列载体基因克隆医学知识51优点：表达效率高产物稳定 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性基因克隆医学知识52优点：基因克隆医学知识52Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白直接纯化产物切割方便： pGEX-1T凝血酶 pGEX-2T-凝血酶 pGEX-3T-X因子位相载体融合型载体-pGEX系列基因克隆医学知识53Ptac：IPTG诱导融合型载体-pGEX系列基因克隆（二）非融合型表达载体 PSDForeign

17、DNA非融合型表达载体非融合基因基因克隆医学知识54（二）非融合型表达载体 PSDForeign DNA非融合型主要元件：强启动子 SD： ATG：第一个密码子基因克隆医学知识55主要元件：强启动子基因克隆医学知识55非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子-温度诱导插入位点-HpaI基因克隆医学知识56非融合型表达载体-pPL-LamdaPL启动子-温基因克隆医学知识培训课件分泌型表达载体-pINIII-ompA1基因克隆医学知识58分泌型表达载体-pINIII-ompA1基因克隆医学知分泌型融合表达载体-pEZZ18基因克隆医学知识59分泌型融合表达载体-pEZZ18基因克隆医学知识

18、59六提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平 强启动子-提高转录水平核糖体结合位点（ATG-SD）避免产物降解 ：分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂基因克隆医学知识60六提高表达水平的手段基因克隆医学知识602、选择合适宿主 Lac 启动子-LacI菌PL/PR - CI857 溶源菌 基因克隆医学知识612、选择合适宿主 基因克隆医学知识613、诱导表达 温度诱导-PLPR /IPTG的化学诱导-Plac、Ptac 4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解基因克隆医学知识623、诱导表达 基因克隆医学知识62七表达产物的检测： 1、特异性鉴定：荧光抗体法免疫沉淀法免疫印迹法ELISA2、生物学活性鉴定 基因克隆医学知识63七表达产物的检测：