阿尔茨海默病(AD)

1、58阿尔茨海默病王建枝 崔德华 晏日强A与ADA的生成途径及其生物学特性提出A假说的依据A的神经毒性作用A发挥毒性作用的机制Tau蛋白与ADTau蛋白异常磷酸化机制及其细胞毒性Tau蛋白异常糖基化及其细胞毒性Tau蛋白基因异常及构象改变Tau蛋白其他类型修饰及其对细胞的影响早老素与ADPS与APP的代谢PS对Tau异常磷酸化的影响PS与细胞凋亡ApoE与ADApoE基因多态性与ADApoE在AD神经变性中的作用AD的实验模型老年斑神经原纤维缠结其他病理改变AD的研究趋势与未来治疗的策略针对A的药物 针对tau异常磷酸化的药物针对轴突转运功能的药物针对胆固醇的药物其他治疗策略阿尔茨海默病Alzh

2、eimer disease，AD是一种最常见的神经退行性疾病，目前，全球大约有2500万AD患者，人口老龄化使AD的患病率呈急剧增高趋势。AD患者的主要临床表现是进行性记忆障碍，其主要病理学特征那么是在脑中形成大量的老年斑senile plaques, SP和神经原纤维缠结neurofibrillary tangles, NFT以及出现弥漫性脑萎缩。AD的病理特征最早在1906 年便由Alois Alzheimer描述了，但其真正的病因发病机制的研究在此后的八十年内都无进展。随着蛋白化学，分子生物学以及遗传学研究技术的迅速提高，从八十年代中叶开始，AD的根底研究才开始有了显著的进展。由于老年斑

3、的主要成分是-淀粉样多肽-amyloid peptide，A，而神经原纤维缠结的主要成分是异常过度磷酸化的微管结合蛋白tauabnormally hyperphosphorylated tau，因此，对AD研究的主流方向主要集中在A和tau两个方面。1984 年，Glenner and Wong 从老年斑内纯化和别离得到了A并解读得到其蛋白序列。这一成果很快引发了竞相克隆转译A的基因。1986年，四个研究组几乎同时发表了APP的基因序列， 揭示了A实际上只是APP中的一小片段。在九十年代初， John Hardy 研究组最先从遗传性AD患者的标本中找到了APP的基因突变。这些成果很快构成了目前

4、比拟流行的A假说。此外，由于早老蛋白presenilin, PS基因突变和载脂蛋白EApoE基因型通过影响A和tau代谢而在AD的发病中起重要作用，因而也受到研究者的重视。本章将从A过量生成、tau异常修饰、PS基因突变和ApoE基因型等方面，重点讨论AD的发病机制、实验模型和治疗策略。A与ADA的生成途径及其生物学特性A泛指一组由3943个氨基酸残基组成的多肽，其中以40个氨基酸的AA1-40为主，其次是A1-42。这些多肽是构成老年斑核心和血管壁沉积物的主要成分。A来自于淀粉样前体蛋白amyloid precursor protein, APP。A PP基因190kbp位于21号染色体长臂

5、，至少由18个外显子组成。由于APP基因转录后的不同剪接，可产生至少10种不同的mRNA和含365770个氨基酸残基的蛋白质异构体。在众多的APP异构体中，人脑主要表达APP695695个氨基酸和APP770770个氨基酸。其中，APP770含一段由57个氨基酸残基组成的插入区kunitz型蛋白酶抑制剂KPI的同源域。APP在细胞中以跨膜受体的结构形式存在，包括一条较长的细胞外N端和一较短的细胞内C端节段，KPI和某些糖基存在于长节段上。APP一般可通过轴浆转运方式向突触端转运并可与细胞外间质相互作用，提示可能对神经元的可塑性有关。此外，APP还可能促进损伤组织的修复。 A由APP分子的跨膜区

6、N-端28个氨基酸及其相邻的跨膜区1115个氨基酸残基组成，其序列为Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln- Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met- Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr。APP主要通过分泌酶secretase途经裂解图1。分泌酶裂解途经由分泌酶水解A的 Lys16-Leu17间的肽键，产生一个较大的N-末端可溶性片断，分泌到细胞介质，而C段小片段那么留

7、在膜上。由于分泌酶的切割位点在A的分子中间，不产生完整的A分子，故又称为非A源性途径。和分泌酶降解途径由分泌酶先水解APP695中的Met-596和Asp-597间的肽键，而分泌酶水解A的39-43位的任意肽键而产生分子长短不等的完整A分子。由于A的C-端最后几个氨基酸残基具有很强的疏水性，所以，C-端越长越易聚合及沉积。A在水溶液中以螺旋、随机螺旋和片层结构三种形式混合存在。片层结构是形成A聚合物必需的结构状态。片层结构的生成数量具有温度、时间和浓度依赖性。温度升高、放置时间延长和A浓度增加均可促进片层结构形成。在溶液的pH值为4-7时，片层结构最易生成。在A聚合过程中，片层结构的A易形成双

8、聚体，逐步形成寡聚体及中间态的初原纤维protofibrils，初原纤维仍具有相对可溶性。在此根底上，初原纤维会快速聚合形成不可溶的纤维状fibrils沉积。另外，溶液中的螺旋在一定条件下也可转成片层结构。某些金属离子，如Zn2+，可加速A聚集和沉积。沉积在SP核心和血管壁上的两种A的成分不同，前者是4243个氨基酸的长肽，后者是3940个氨基酸的酸性多肽。A是神经系统所有细胞APP代谢的正常产物。在正常情况下，A的产生和降解保持平衡，且体内有一些因素保持A的可溶性。在家族性AD患者，APP和PS基因多个位点的突变以及ApoE 4纯和基因表型均可导致A的过量产生与沉积，从而造成神经性毒性作用。

9、用突变APP Val642Phe基因转染神经瘤细胞可使该细胞A1-42产量增高，更易形成不溶性A纤丝，并逐渐产生SP等病理变化。在两个早发瑞典型AD家族中发现APP770的Lys670Asn和Met671Leu基因双突变，此串联双突变正好位于分泌酶的切割位点。将人工构建的此瑞典型突变的APP770基因转染人肾293细胞或M17神经瘤细胞，发现A的生成比用原型APP770基因转染的细胞增加58倍，释放到介质中的A增加6倍。说明该突变为分泌酶提供了更适宜的底物，因而产生更多的A沉积。C83 C83 C图1 A假说的依据多数研究者认为，A在AD发病中起决定性作用，此即“A假说。现将支持这一假说的依据

10、归纳如下：i所有AD病人脑中存在的神经斑块主要是由A构成的。ii在体外培养和体内实验中，合成的A多肽对海马和皮层的神经元都有毒性。iiiAPP基因位于人类21号染色体的长臂上，在中年21三体唐氏综合征患者可见典型的AD样神经病理学改变和临床表征，但在一种罕见的唐氏综合征患者21号染色体APP基因为二倍体而不是三倍体那么不出现痴呆，且这类患者直到高龄死亡时脑内仍未发现AD样神经病理学改变。iv在APP基因中，位于A区域或与A相邻区域的基因突变可升高A水平并改变其聚积特性，从而引起早发性AD。vPS1和PS2基因的遗传性突变可提高A42/A40比值，导致早发性AD且病程进展快。viApo E的4等

11、位基因是AD的遗传危险因子之一，4纯合子增加人脑的A负荷。vii含人类突变APP基因的转基因小鼠表现为胞外A量随时间延长而增高，发生特定的类似于AD的神经病理和行为的改变。尽管如此，对A假说仍存在争议。回忆相关研究结果，其主要问题是A水平或脑内淀粉斑的负荷与记忆和认知损伤的严重程度之间关联性不明确。然而，最近有研究说明，降低患者脑皮层A水平可延缓记忆和认知能力下降的进程，提示A在记忆和认知中起作用。A的神经毒性作用导致过氧化损伤 A可导致神经细胞的过氧化损伤，许多抗氧化剂有保护培养的中枢神经细胞及克隆的细胞系免受A的毒性作用。AD患者超氧化物歧化酶SOD、脑葡萄糖6磷酸脱氢酶G6PD活性增高、

12、谷氨酰胺合成酶GS活性降低、脂质过氧化物增多，说明自由基和过氧化损伤与AD关系密切。A介导神经细胞过氧化损伤可能涉及多个途径。如i损伤生物膜：A可诱导产生自由基，从而引起广泛和严重的生物膜损害。A主要攻击生物膜脂质双层结构的磷脂多不饱和脂肪酸，使其CC双键与自由基反响，生成有细胞毒性的脂质自由基和脂质过氧化物。后者又可自动分解形成更多的自由基，作用与其他双键，产生新的脂质自由基，并一次传递成为自由基链式反响。铁、铜等金属离子及其复合物，可加速生物膜的破坏，使膜的流动性、通透性增加，组织水肿、坏死。ii破坏细胞内钙离子稳态：A可在细胞膜双层脂质中形成允许Ca2进出的通道，导致细胞内钙平衡失调，细

13、胞内钙离子增加导致氧化应激的进一步增强。例如，钙离子介导的磷脂酶活性增加可引起花生四烯酸水平增加，而这一反响的结果产生氧自由基。线粒体内过量钙离子那么导致异常电位传递以及超氧化物阴离子浓度增加。钙离子阻滞剂可以减轻A的细胞毒性。iii抑制星形胶质细胞：围绕在老年斑周围的反响性星形胶质细胞是AD病理改变的标志之一，星形胶质细胞对细胞外谷氨酸的摄入起重要作用。在培养的星形胶质细胞中，由A诱导产生的自由基可抑制星形胶质细胞对谷氨酸的摄入。这种抑制作用将导致细胞外谷氨酸水平增高，而谷氨酸对神经元具有兴奋性毒性作用。星形胶质细胞摄取谷氨酸的过程依赖ATP，故当葡萄糖摄入或分解障碍时，谷氨酸的摄入即被阻断

14、。iv失活某些关键酶：蛋白质的氧化损害可使羰基含量增多，可能与组氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸氧化作用有关。蛋白质中这些氨基酸的氧化改变将导致GS、肌酸激酶CK等关键代谢反响酶的失活。引起神经细胞凋亡 将A和胎鼠海马或皮层神经元一起培养，发现培养的神经元形态改变、DNA断裂、核染色质固缩、细胞膜起泡和梯形DNA电泳条带等典型细胞凋亡形态学和生化学改变。A也引起SY5Y细胞凋亡，且被凋亡抑制剂金精三羧酸ATA阻断。假设把ATA参加到已出现明显形态学退变的培养神经元中，可阻断DNA裂解，提示在细胞凋亡过程中，形态学改变早于DNA断裂。A引起细胞凋亡具有氨基酸顺序和构型依赖性，反向序列或序列被重编的A

15、都不能导致细胞凋亡。 引起炎症反响 头部损伤、感染等是AD发病潜在的危险因素，用非类固醇抗炎药可延缓或防止AD；在AD患者的老年斑内含有各种补体成分包括C1q，C4d，C3b，C3C，C3d和C5b-9，急性期蛋白，激活的小胶质细胞等炎性标记物。这些资料均提示AD病变涉及炎性反响过程。A参与这一炎性反响的局部证据为：A刺激小胶质细胞产生过量C3；A能和C1q结合激活非抗体依赖性经典补体通路。损伤突触功能 神经病理学家早就试图在认知损害程度与老年斑和缠结数量之间建立定量的关联。总结大量的研究资料，发现NFT数量与痴呆严重程度的关联优于淀粉样斑块。然而，统计学上最正确的关联性那么是突触密度与痴呆的

16、程度。应用电子显微镜或免疫组织化学对突触标记物染色进行的定量检测结果证明，AD脑中相关皮层和海马的突触密度显著降低。此外，突触数量的减少与神经细胞胞体的减少似乎不成比例，说明在疾病进程中突触末梢的改变可能是神经元变性死亡的早期事件。大量研究资料显示：突触功能损伤早于A沉积或淀粉样斑块的形成。人脑皮层可溶性A水平升高与突触和认知损伤的严重程度之间呈正相关；APP V717F转基因小鼠的学习能力缺损也常常出现于淀粉斑形成之前，并伴有海马CA1区突触传递和突触素synaptophysin以及MAP-2免疫染色的减少。这些均提示是可溶性A而不是纤维斑块损害神经元的突触功能。“可溶性A是指脑组织提取物经

17、高速离心后依然存在于水溶液中的所有A形式，常用ELISA技术进行检测。由于ELISA不能显示A的聚积状态，因此，“可溶性A实际上只是一个操作性术语。有人用Western blot检测AD患者大脑皮质的可溶性级分时，发现A以单体4kDa和十二烷基硫酸钠sodium dodecylsulfate，SDS稳定的寡聚体8 和 12 kDa形式存在。类似的寡聚体也见于人类海马的CA1和内嗅皮质区，而在这些脑区没有观察到淀粉样斑块，提示A寡聚体的积聚可能发生在疾病的早期。A寡聚体，也包括特定合成的可溶性、非纤维状A源性可扩散配体ADDLs。ADDLs是将合成的A1-42置于冰冷的Hams F12环境中培养

18、而产生的直径约为5nm的球状结构，这类A在SDS中的表观分子量分别为4，8，16和18kDa。进一步用分子筛色谱技术的研究结果证明，低分子量的ADDLs阻断LTP，具有神经毒性，破坏突触可塑性和学习记忆。更大的A聚合体，即A初原纤维protofibrils，PF聚合体也可快速改变神经元的功能。与ADDLs 不同的是，PF可在体外多种生化条件下产生，而且它们的形成速率与A的浓度、pH值以及离子力有关。PF表现为真正的纤维中间产物，因为它们既可形成纤维，又可分解为不同类型的低分子量的A。在一个全细胞电流钳记录模式中，参加PF会引起动作电位的立即增高以及大量的膜去极化，这说明PF可改变细胞膜的兴奋性

19、。这种兴奋性改变是可逆的，而且有浓度依赖性，极卑微摩尔浓度的PF就可引发电活动。此外，实验显示PF有着与纤维截然不同的电生理活性，因为参加特定NMDA拮抗剂D-APV可将PF激发的神经元电活动减弱72，而同样剂量的D-APV只能将纤维激发的电活动减弱38。与之相反，应用非NMDA拮抗剂NBQX对于PF诱导的电活动只能产生减弱23的效果，但可减弱大约50的由纤维诱导的电活动。这些数据说明谷氨酸受体通道参与了PF诱导的神经元兴奋性，而合成的PF和纤维可能至少有一局部是通过不同的神经生物学机制起作用的。在培养的人类胎儿神经元和人类脑脊液中检测到可溶性A寡聚体，说明可溶性聚合体如ADDLs和PF在人类

20、的神经元中产生和释放，并在细胞外发挥神经毒性作用。上述实验结果主要来自于对胞外A寡聚体的研究。最近的研究说明，神经元细胞内的A寡聚体也影响突触功能，对这一级分的A的研究已引起广泛关注。A毒性作用的机制A纤维聚合假说 A的神经毒性作用与其折叠结构有关。尽管折叠本身并无神经毒性，但是折叠导致A形成丝状聚合物，使A由可溶性变为不溶性沉淀而发挥神经毒性作用。将A分别溶解在100%二甲基亚砜、0.1%三氟乙酸或者35%乙腈/0.1%三氟乙酸中，测定不同媒介中折叠的含量和纤丝生成速度的关系，发现媒介中高折叠含量对A纤丝聚合起关键作用。尽管A是许多细胞的正常代谢产物，但A水平的升高会促发聚合。促使可溶性A转

21、变成具有神经毒性作用的因素仍未明了，以下因素都可造成A水平的提高：iAPP基因突变：如含有670-671双突变APP基因的肾293细胞和人M17神经纤维细胞A片断表达比正常APP基因高6倍。iiA去除减弱：在AD患者老年斑中存在1ACT，nexin-I等数种蛋白酶抑制剂，使A不能被蛋白酶及时去除而形成不可逆沉淀。iii异常翻译后修饰：如氧化、糖化、异构化和异常磷酸化均可影响纤维形成和抑制A的正常降解作用。iv理化因素：铝、铁、锌以及经37C老化处理均可促进A纤丝聚合。值得强调的是：A受体中介假说 目前有两种受体参与中介A的神经毒作用，即晚期糖化终产物受体receptor for advance

22、d glycation end products，RAGE和清道夫受体scavenger receptor, SR。前者存在于神经元，小胶质细胞和血管内皮细胞，后者仅存在于小胶质细胞。A与两种受体相互作用，最终导致神经元退变和死亡。 小胶质细胞中介假说 关于A神经毒作用的途径有两种说法：一种认为A能直接杀死神经细胞，另一种那么认为A神经毒作用由上述受体或小胶质细胞中介。其中，小胶质细胞中介假说的主要依据是i海马纯神经元培养液中含100M A约为正常生理量的1000倍不引起神经元的损伤，即使从老年斑提取的A也不对神经元起杀伤作用。而参加100 nM A至含小胶质细胞的神经元培养体系时，那么对海马

23、神经元起明显杀伤作用。ii外周血单核细胞与A保温3天后洗除A，再与大鼠脑组织共培养可引起神经元死亡，而未受A激活的单核细胞那么无此作用。iiiA脑室或脑实质直接灌流，不对神经元起杀伤作用。iv有些正常老人的A沉积斑块数目可与AD患者相似，但无神经元损害的表现。这些事实说明A对神经元的神经毒作用与炎症或小胶质细胞激活密切有关。神经细胞轴浆转运障碍假说 APP在神经细胞的内质网合成后，首先通过轴突被转运到突触末端，然后通过“细胞内转运作用transcytosis，运回到神经元胞体和树突。这一转运过程对维持APP的正常代谢起重要作用，并影响A的生成。这一转运过程依赖APP和PS的相互作用。在家族性A

24、D患者，无论是APP还是PS基因突变，都可影响APP和PS的相互作用，使APP转运障碍而产生过量A，后者又进一步阻碍APP的正常转运。在散发性AD患者，A总体水平不增高，以下因素可能造成局部A聚积而影响APP的转运：i自由基共价结合到A分子形成局部的核或“种子结晶，使之在胞内聚积并抑制其转运。ii阳电荷蛋白如肝素硫酸蛋白聚糖可加快A聚积。iii血浆淀粉样蛋白成分P由相同的两个5聚体组成，每个分子具有10个A结合位点，如果这种分子存在于胞内特定部位，那么可导致胞内局部聚积高浓度A。内质网相关蛋白-A复合物毒性假说 内质网相关结合蛋白ERAB由262个氨基酸组成，主要存在于肝脏和心脏，在正常脑神经

25、元呈低水平表达。在AD脑中，特别是A沉积的邻近部位，ERAB含量增加。ERAB缺少信号肽和转膜序列，当与A1-42结合后可引起ERAB的再分布，使之从内质网向浆膜转位，这一过程中形成的ERAB-A复合物对神经元有毒性作用。A1-42和ERAB结合还可明显影响APP的转运，导致APP以及tau、-synuclin等在内质网滞留而影响神经元突触的功能，使神经元氧化功能减退并发生凋亡。抗ERAB抗体对上述损伤有拮抗作用。图2小结A毒性学说及其机制。APP/PS基因突变APP/PS基因突变A产生A去除A水平升高并聚积损伤生物膜破坏胞内钙稳态引起炎症反响引起过氧化损伤损伤突触功能神经元退行性变痴 呆图2

26、. A毒性学说及其机制Tau蛋白与ADTau蛋白是神经细胞主要的微管结合蛋白。从正常成人脑中别离的tau在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中至少有56种异构体isoform，表观分子量约在4860kDa之间。这些异构体是位于17号染色体的单一基因转录物mRNA的不同剪接产物，包括C-末端含3个或4个重复序列3132个氨基酸、可结合微管的3R-tau和4R-tau，以及N-末端含0个、1个或2个插入序列29或58个氨基酸的0N-tau、1N-tau和2N-tau图3，其中4R-tau更易聚积。胎脑中tau蛋白不含N-末端的插入序列，因而在上述变性胶电泳中于48kDa处显一条较宽的区带。此外，牛脑微管蛋白的

27、双向电泳显示30余种tau的异构体，等电点在6.58.5之间。分子量越大，酸性越强，tau分子的等电点差异与其磷酸化修饰状态相关。正常tau蛋白是一种含磷蛋白质，每克分子tau蛋白中磷酸含量为2-3克分子。图3 人Tau的根本结构Tau图3 人Tau的根本结构Tau亚型人Tau基因Tau前转录物转录剪接用不同生化别离技术可将AD脑中的tau蛋白分成三个级分，即胞浆正常修饰的tau蛋白C-tau，异常修饰易溶型tau蛋白AD P-tau和异常修饰并聚积为双螺旋丝paired helical filament，PHF的tau蛋白PHF-tau。PHF是以右手螺旋盘绕形成的双螺旋丝结构，螺旋丝的直径

28、约为2224nm，每80nm处有一狭窄区，其直径约为10nm。根据PHF-tau在2%的SDS中的溶解性差异，又可将其分为PHFI-tau和PHFII-tau蛋白。PHFI在电镜下常见的是单个的短双螺旋丝，在室温下即可溶于2% SDS，而PHF-II在电镜下常以缠结形式存在，且需在上述SDS和-巯基乙醇溶液中用反复加热或超声破碎法抽提。AD患者脑中别离的tau在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显3条带，表观分子量在6272kDa之间。最近的研究发现：tau蛋白异常不仅在AD的发病中起重要作用，还参与其他20余种神经退行性疾病的病理过程。因此，对tau的研究正在引起更多科学工作者的重视。目前在AD患者脑

29、中发现的tau蛋白异常修饰包括：异常磷酸化、异常糖基化、异常糖化、异常泛素化、异常截断作用和异常硝基化。此外，在其他神经退行性病中还发现tau基因异常、构象改变和多胺化等。Tau蛋白异常磷酸化机制及其对细胞的毒性作用AD脑中C-tau水平明显低于对照组，而tau蛋白总量却显著高于对照者，其增高的局部为异常过度磷酸化的tau蛋白。生化分析结果显示：AD患者每克分子tau蛋白的磷酸含量为5-9克分子，比正常水平增高约25倍。自从Iqbal小组在1986年首次报道异常磷酸化的tau蛋白是AD患者脑神经元中PHF/NFT的主要成分以来，迄今已发现PHF-tau 的40多个位点发生了异常过度磷酸化。与其

30、他含磷蛋白质一样，tau蛋白的磷酸化受蛋白激酶和磷酸酯酶的双重调节，前者的功能是使蛋白质磷酸化，而后者那么是去磷酸化。因此，蛋白激酶和磷酸酯酶系统调节失衡是导致tau蛋白异常磷酸化的直接原因。蛋白激酶在AD 样tau蛋白异常磷酸化中的作用 蛋白激酶的作用是催化蛋白质发生磷酸化。因此，蛋白激酶活性增高将导致tau蛋白异常过度磷酸化。由于至今尚未能在AD患者脑中检测到任何蛋白激酶的生化活性增高，因此，对蛋白激酶在AD中的作用及其调节机制尚不确定。然而，大量体外和动物整体水平的研究证明，多种蛋白激酶可催化tau蛋白的AD样过度磷酸化和聚积。蛋白激酶的催化性质及其与tau蛋白磷酸化的关系：根据蛋白激酶

31、催化靶底物磷酸化反响的序列特点，可将丝氨酰/苏氨酰蛋白激酶分为两大类型：i脯氨酸指导的蛋白激酶proline-directed protein kinase，PDPK，这类酶催化底物磷酸化反响的序列特点是-XS/TP-X，任一氨基酸，S，丝氨酸，T，苏氨酸，T，脯氨酸。ii非脯氨酸指导的蛋白激酶non-proline-directed protein kinase，non-PDPK。在的AD tau蛋白异常磷酸化位点中，约有半数为PDPK位点，另一半为non-PDPK位点。能使 tau蛋白发生磷酸化的PDPK主要有：细胞外信号相关的蛋白激酶extracellular signal relate

32、d protein kinase，ERKs、细胞分裂周期cell division cycle，cdc蛋白激酶-2、周期蛋白依赖性激酶-2cyclin-dependent kinase-2，cdk-2、周期蛋白依赖性激酶-5cyclin-dependent kinase-5，cdk-5和GSK-3。能使tau蛋白发生磷酸化的non-PDPK有：环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶cyclic-AMP-dependent protein kinase， PKA、蛋白激酶 Cprotein kinase C，PKC、钙/钙调素-依赖性蛋白激酶IIcalcium/calmodulin-dependent pro

33、tein kinase II，CaM KII、大鼠小脑源性钙/钙调素-依赖性蛋白激酶Gr kinase、酪蛋白激酶-1casein kinase-1，CK-1和酪蛋白激酶-2CK-2。由此可见，可能有多种蛋白激酶参与了AD患者 tau蛋白的异常磷酸化过程。不同蛋白激酶催化tau 蛋白磷酸化效率各异，且磷酸化后抑制tau蛋白生物学功能的程度也不同。研究还发现：上述激酶单独使用时对tau蛋白的磷酸化作用非常缓慢，假设将tau蛋白先分别用PKA、CK-1、PKC等non-PDPK预保温，那么可显著提高后续的PDPK如GSK-3催化tau蛋白发生磷酸化的速率，从而显著增高tau的磷酸化水平。说明tau

34、蛋白由PDPK催化的磷酸化反响，可能受non-PDPK的正性调节作用。蛋白磷酸酯酶在AD 样tau蛋白异常磷酸化中的作用 根据结构、组成、所催化底物的特异性、激活剂与抑制剂的不同，可将哺乳动物体内的蛋白磷酸酯酶protein phosphatases，PP分为五类，即PP-1、PP-2A、PP-2B、PP-2C和PP-5，它们均存在于人脑神经元中。用从AD脑中别离的异常磷酸化的tau 简称AD P-tau作底物，PP-1、PP-2A、PP-2B和PP-5均可使AD P-tau多个位点磷酸化并不同程度的恢复其促微管组装活性，而PP-2C那么无上述功能。用蛋白磷酸酯酶抑制剂处理培养的细胞可导致ta

35、u蛋白异常磷酸化、中间丝结构改变以及微管、神经元突触和树突丧失；在整体水平抑制PP-2A和PP-1也可引起tau蛋白发生AD样磷酸化。上述资料从不同水平和角度说明：PP-2A、PP-2B、PP-1和PP-5参与tau蛋白的异常磷酸化。此外，研究还发现：PP-2A和PP-2B催化PHFII-tau去磷酸化所需要的酶量远高于使易溶型AD P-tau和胎脑tau去磷酸化所需的酶量，且去磷酸化的位点比AD P-tau少，说明PHF/NFT结构的空间位阻效应可能不利于蛋白磷酸酶对tau蛋白的去磷酸化作用。PP-2A和PP-2B使AD异常磷酸化tau蛋白的去磷酸化活性可被二价金属阳离子Mn2+和Mg2+激

36、活，其中Mn2+的激活作用最强；Ca2+/钙调素Ca2+/calmodulin也可增高PP-2B使异常tau蛋白的去磷酸化活性。这些资料对AD药物研究有一定参考价值。下面介绍几种磷酸酯酶催化tau去磷酸化的相关调节。PP-1：PP-1在锥体神经元胞膜、胞浆、及亚细胞器均有表达，它是由催化亚基C和不同的调节亚基构成的寡聚体。PP-1在神经细胞的功能尚不清楚，它可能通过调节长时程抑制long-term depression，LTD而参与学习记忆过程。PP-1的主要抑制剂有抑制因子-1Inhibitor-1，I-1，抑制因子-2Inhibitor-2，I-2，冈田酸Okaidaic acid，OA，

37、Ki 100nM和花萼海绵诱癌素Calyculin A，CA，Ki 50nM，其中，I-1和I-2为PP-1的生理性抑制剂。PKA激活使受多巴胺和cAMP调节的32kDa磷蛋白Dopamine and cAMP regulated phosporylation，DARPP32和I-1磷酸化，进而抑制PP-1；PP-2B等磷酸酯酶那么使DARPP32和I-1脱磷酸化而激活PP-1，活性型PP-1参与LTD。I-2是PP-1的分子伴侣，有助于PP-1蛋白的正确折叠及空间构象的维持。Tau作为锚锭蛋白，将PP-1和微管联系起来，三者发生协同作用，PP-1借此调节tau的磷酸化状态。PP-1在体外对A

38、D异常磷酸化的tau有微弱的脱磷酸化作用，它在AD脑中的活性降低。虽然细胞水平的研究支持PP-1参与tau的磷酸化，但关于整体情况下PP-1对tau的调节仍知之甚少，PP-1在体内还可能通过抑制GSK-3、cdc-2、cdk-5等激酶而调节tau蛋白的磷酸化水平，因为在有代谢活性的脑片研究中，共同使用OA和CA引起PP-1活性100抑制时，上述激酶活性也明显下降，且未发现tau在所检测位点Ser198/Ser199/Ser202, Ser262/Ser356等的异常磷酸化。PP-2A：PP-2A是由调节亚基A、B和催化亚基C构成的异三聚体。脑中PP-2A的主要形式是ABC，集中分布于锥体细胞的

39、胞浆，线粒体、微粒体等细胞器亦有少量分布。PP-2A分别与tau和微管的不同位点结合，其中任一成分的改变都将改变三者之间的相互关系，从而影响PP-2A对tau磷酸化状态的调节和微管的结构与功能。PP-2A在tau蛋白的AD样异常磷酸化中可能起关键性作用，其依据如下：iPP-2A催化AD P-tau去磷酸化的Km值为8.02.8M，而PP-2B为9.71.8M。ii在体外将AD P-tau分别与不同蛋白磷酸酶保温再定量检测其磷酸释放量，假设以硝化后再灰化的AD P-tau所释放的磷酸量为100%，发现PP-2A使AD P-tau水解释放的磷酸量为57%，而PP-2B和PP-1那么分别为36%和3

40、0%。iiiPP-2A、PP-2B和PP-1使AD P-tau和PHFII-tau去磷酸化后可不同程度恢复其促微管组装的生物学活性，以微管形成的初速度及最后形成量为参数，PP-2A对AD P-tau的生物学活性恢复能力比PP-2B和PP-1强。ivPP-2A催化AD P-tau去磷酸化以及使PHFII/NFT的缠结松解，释放游离tau蛋白所需要的酶量比PP-2B和PP-1低。v假设在细胞或组织水平抑制PP-2A可引起tau蛋白发生AD样磷酸化和细胞骨架的破坏，而抑制PP-2B那么不引起相同的效果。vi用PP-2A的抑制剂OA侧脑室慢性投递在引起tau蛋白AD样磷酸化的同时，伴有大鼠空间学习记忆

41、障碍。vii最新研究报道，在AD患者脑内，PP-2A的两种抑制剂I1PP2A 和I2PP2A与PPPP-2B：PP-2BCalcineurin是一种Ca2+结合蛋白，为脑中含量最高的磷酸酯酶，主要分布于神经细胞的核周质和树突，是由一个可与钙调素CaM结合的61kDa的催化亚基CA和一个能与Ca2+结合的17kDa的调节亚基RB构成的异二聚体；它有A和A两种异构体，在脑中主要以A形式存在。PP-2B的酶活性需CA和RB紧密结合，并依赖于Ca2+-CaM的激活，Mn2+和Ni2+可增强该酶活性。PP-2B在神经细胞的功能仍不清楚，有资料显示它参与海马神经元的LTP和长时程抑制LTD。PP-2B在体

42、外可使AD P-tau多个位点脱磷酸化，其脱磷酸化活性仅次于PP-2A。AD脑内PP-2B活性明显下降，由于PP-2B与细胞骨架密切相关，它在AD某些脑区的分布与NFT的分布重叠，而其活性下降程度那么与NFT数量呈负相关，而且，最新研究发现，从人脑纯化出的PP-2B可选择性的使AD P-tau某些位点去磷酸化，特别是Ser-262和Ser-396位点，而Ser-262是唯一位于AD tau蛋白微管结合域的磷酸化位点，该位点发生磷酸化可降低tau蛋白与微管结合的能力。因此，PP-2B可能是参与tau体内调节的另一个关键酶。基因敲除的小鼠海马苔藓神经元出现tau蛋白的过度磷酸化，电镜显示其细胞骨架

43、异常，同时伴有学习记忆障碍，推测PP-2B活性下降可能通过tau异常磷酸化导致微管等细胞骨架结构和功能异常，进而引起小鼠学习记忆障碍。PP-5：是最近发现的一种磷酸酯酶，在脑神经元内高表达，体外实验及细胞培养证实PP-5可使tau的多个位点去磷酸化。PP-5对tau磷酸化的调节机制及其在AD发病中的作用尚待进一步研究说明。Tau蛋白酪氨酸位点的磷酸化：过去的研究说明，AD样tau蛋白异常磷酸化只发生在丝氨酸和苏氨酸位点。最近的研究显示，酪氨酸磷酸化位点特异性的抗体只结合纯化的PHF-tau而非正常tau，提示酪氨酸位点磷酸化可能也参与AD样tau病理学。在转染细胞内，非受体酪氨酸激酶fyn可结

44、合并使tau蛋白的Tyr18位点磷酸化；在小鼠的早期发育阶段也可见tau蛋白Tyr18的磷酸化，但这一位点的磷酸化在成年期消失；用A处理人和大鼠的原代脑皮质培养神经元，可见tau的Tyr29位点发生迅速而短暂的磷酸化；用磷酸酯酶的抑制剂pervanadate处理转染人tau的COS-7细胞，发现tau的Tyr394位点磷酸化，且该位点的磷酸化见于AD脑内而在正常人脑几乎没有。有关PHF-tau的酪氨酸位点磷酸化的生理病理意义尚待进一步探讨。Tau蛋白异常磷酸化对细胞的毒性作用 tau蛋白的生物学活性是维持其功能的根底。正常tau的生物学功能主要表达在i与管蛋白结合组装成微管，ii与已经组装形成

45、的微管结合以维持其稳定性。这两种活性可分别通过测定tau蛋白与管蛋白tubulin的混合液在350nm处光吸收值的改变、负染电子显微镜技术观察微管的组装microtubule assembly assay以及tau蛋白与紫杉酚催化生成的微管的结合microtubule binding assay能力而检测。异常磷酸化的毒性作用是：使tau蛋白上述生物学活性降低或丧失；AD P-tau除其本身丧失生物学活性外，还可与管蛋白竞争与正常tau结合或从已经形成的微管上夺取tau蛋白；AD P-tau还可结合高分子量的微管相关蛋白high molecular weight-MAP，HMW-MAP-1和-

46、2，并从已形成的微管上夺取HMW-MAP，从而使微管解聚并最终崩溃。有趣的是：PHF-tau中的大局部异常磷酸化位点都存在于大鼠及人类胎脑tau蛋白分子中。然而，在胎脑中的tau虽然以过度磷酸化形式存在，但仍保持其完好的生物学活性和功能，这一特性与AD P-tau 和PHF-tau迥异，其机制尚不清楚。Tau蛋白异常糖基化机制及其细胞毒性糖基化glycosylation作用是指在特定糖基转移酶的作用下，将糖基以共价键N-糖苷键或O-糖苷键形式连接到蛋白质分子形成糖蛋白glycoprotein的过程。AD异常磷酸化的tau蛋白被异常糖基化修饰。异常修饰的糖基为：末端连接的甘露糖、唾液酸-(2-3

47、)糖苷键末端连接的半乳糖、-半乳糖(1-3)-N-乙酰半乳糖胺和-半乳糖(1-4)-N-乙酰半乳糖胺。这种修饰以N-糖苷键连接为主。异常糖基化的可能机制 正常组织中蛋白质的糖基化作用是发生于内质网和高尔基体内的蛋白质合成过程的翻译中如N-糖苷键或翻译后N-糖苷键和O-糖苷键的修饰事件，而该过程中所涉及的糖基转移酶常以膜结合形式存在。tau蛋白存在于胞浆中，其糖基化修饰可能意味着某种类型的膜结构异常，从而使tau蛋白与糖基转移酶有相互接触的时机。在AD患者发现有膜脂和膜流动性异常支持了上述假设。此外，已发现的三种与早老有关的蛋白质，PS-1和PS-2以及APP均为膜蛋白，前二者被认为只特异性地存

48、在于家族性AD患者的粗面内质网和高尔基体。所以，探索tau蛋白的异常糖基化和膜蛋白PS和APP异常之间的关系，对说明AD发病机制有重要意义。 异常糖基化的细胞毒性 将PHF-tau/NFT与糖苷酶在37保温30分钟，再进行负染电子显微镜检查，发现经糖苷酶处理的样品其螺旋结构消失，形成更加紧密，伸展束状的纤维丝结构，束状纤维丝中单个纤维丝的直径约为2.50.5nm。单纯去糖基化作用不能恢复tau蛋白的生物学活性，也不显著增加tau蛋白从PHF/NFT结构中的释放，然而，去糖基化后再用PP-2A处理可使PHF/NFT释放的游离tau蛋白量比单纯用PP-2A去磷酸化所释放的tau量显著增高。可见：i

49、AD患者的脑损伤至少在体外是可以逆转的；iitau蛋白的异常磷酸化在PHF/NFT的形成及稳定性维持中均起作用，而tau蛋白的糖基化作用那么主要与PHF结构的稳定性，尤其是PHF结构中螺旋的周期性维持有关。糖基化作用可引起分子间的广泛交联cross-linking，还可能引起“氧应激，“氧应激状态产生的氧自由基oxygen free radicals影响细胞的信息传递，并产生细胞毒性。异常糖基化与磷酸化的关系 关于tau蛋白异常糖基化与异常磷酸化的相互关系尚未说明。根据异常磷酸化的tau蛋白存在于缠结形成前期pretangle神经元，以及从AD患者脑中可别离出易溶型AD P-tau的事实，推测

50、tau蛋白的异常磷酸化是PHF形成的早期事件。异常磷酸化tau蛋白的易自聚性self aggregation可能使其在受累神经元中形成一个“发源点， 加上过度磷酸化引起的细胞内醛糖磷酸基浓度增高，因而使tau蛋白容易发生糖基化。可见，tau蛋白的异常磷酸化可能促进其异常糖基化。进一步研究发现，tau的糖基化可促进其磷酸化，其机制是通过在底物水平加速tau的磷酸化或抑制tau的去磷酸化。最近的研究显示：从尸检人脑中纯化的tau可见N-乙酰-O-糖基化O-GlcNAcylation，O-GlcNAc修饰的tau蛋白，提示O-GlcNAc可能参与调控tau的磷酸化。然而，在培养的成神经瘤kelly细

51、胞中O-GlcNAc作用主要见于低度磷酸化的tau，而体外异常过度磷酸化的tau却无O-GlcNAc，提示tau的O-GlcNAc可能通过基团竞争机制抑制tau的磷酸化，即当tau的O-GlcNAc降低时，更易发生磷酸化。据此，AD脑内葡萄糖的吸收及代谢障碍可能通过下调tau的O-GlcNAc导致tau的异常磷酸化和神经变性，这方面的研究局部解释了脑糖代谢障碍与AD的关系。Tau蛋白基因异常及构象改变tau蛋白基因突变包括tau基因编码区突变如12外显子点突变以及编码区错义突变分别位于9、10、13外显子。某些微管结合区保守残基的突变可影响tau蛋白与微管结合功能并使其更容易聚积，使患者脑中出

52、现典型的AD样PHF/NFT病理改变。此外，在非编码区如外显子10剪切位点的突变可引起外显子10异常剪切，使患者脑内3R-tau和4R-tau组成比率改变。至今，尚未在AD患者发现tau基因的突变。对tau基因突变的研究主要来自于一种家族性神经退行性疾病，即17号染色体连锁遗传性额颖叶痴呆帕金森病(inherited frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome-17，FTDP-17)。已从100多个FTDP-17家庭中鉴定出32种tau突变基因，包括编码区的错义突变、缺失突变、寂静突变以及外显子10下游内含子剪切

53、位点附近的内含子突变。其中约半数的突变在蛋白水平发挥主要作用，它们降低tau蛋白与微管的结合能力并促进tau聚积成异常细丝。其他突变在RNA水平发挥首要作用并干扰4R-tau和3R-tau比率，从而导致脑内4R-tau相对增加。Iqbal小组最近发现4R-tau比3R-tau更易被脑内的蛋白激酶磷酸化并聚积成细丝。在转基因小鼠，过度表达FTDP-17突变的tau可促进异常磷酸化PHF/SFstraight filamentstau及NFT的形成。因此，FTDP-17家族tau突变一方面可能通过改变tau蛋白的构象使其成为脑内蛋白激酶的更好底物，而使tau蛋白更易发生异常磷酸化且在较低的磷酸化水

54、平更易迅速的自我聚积。另一方面，由于PP-2A依赖结合于tau基因的串联重复序列发挥作用，而几种基因突变的tau蛋白那么降低了与PP-2A结合的能力。因此，tau基因突变可能在神经变性及痴呆的发生开展中起重要作用。Tau蛋白其他修饰及其对细胞的影响Tau蛋白异常糖化 AD脑中tau蛋白被异常糖化glycation。糖化是指蛋白质分子自身的-NH3与细胞内糖类物质的醛基经氧化形成Shiffs碱，再经分子内重排而形成不溶性、抗酶解且不可逆的交联体晚期糖化终产物advanced glycation end products，AGE的过程。tau蛋白分子中含赖氨酰残基约占其氨基酸总量的10%，所以富含

55、-NH3，亦极易形成AGE。AGE的形成可能促进了PHF转变成NFT，导致神经细胞不可逆性损害。在体外将重组tau蛋白与葡萄糖一起保温，已经成功获得糖化的tau蛋白。Tau蛋白异常泛素化 PHFII-tau被泛素化ubiquitination，这种修饰不存在于C-tau及AD P-tau和PHFI-tau样品中。泛素是一个由76个氨基酸组成的多肽，通过其C-端甘氨酸与靶蛋白的-或-氨基结合。正常情况下，靶蛋白与泛素结合后通过泛素蛋白酶小体proteasome途径被降解。假设泛素降解途径功能异常或被降解的蛋白质结构改变，与泛素结合的靶蛋白不能被降解去除，那么在细胞中积聚形成包涵体inclusio

56、n，导致细胞退变死亡。AD患者脑中泛素含量明显增高，并主要存在于PHFII/NFT中。PHFII-tau的泛素化修饰可能是机体试图对其进行水解去除的一种代偿反响。Tau蛋白异常截断作用 tau蛋白的截断作用truncation是指tau蛋白N-端或C-端被酶切除而使其分子变短的过程。体外实验显示：截断后的tau蛋白容易形成二聚体，并失去其生物学活性，tau蛋白的截断作用还参与小脑颗粒细胞的凋亡过程。最近对AD病人尸检发现，tau的截断现象参于了AD脑内NFT的形成过程。而在体外实验中，tau蛋白的截断片段可促进神经细胞凋亡。Tau蛋白异常硝基化 最近，在AD患者NFT和tau包涵体中发现异常的

57、硝基的tau蛋白，提示tau的硝基化可能参与AD的病理过程。体外用强的氧化剂过氧亚硝酸盐peroxynitrite，ONOO-处理tau可导致3-硝基酪氨酸 3-nitrotyrosine，3-NT免疫反响性，并形成SDS和热稳定的寡聚体，此高规那么聚集物以双酪氨酸键稳定，而且这种3-NT修饰的tau在AD脑内及脑脊液中异常增高。Tau含有5个酪氨酸位点，分别是Tyr18、Tyr29、Tyr197、Tyr310和Tyr394，体外使用过氧亚硝酸盐硝基化tau时，发生硝基化的酪氨酸位点主要是Tyr18和Tyr29，这些位点硝基化可抑制tau蛋白聚积，但在AD脑内tau的硝基化位点及性质尚不清楚。

58、Tau蛋白的多胺化 多胺化polyamination指在组织谷氨酰胺转移酶的作用下，蛋白酪氨酸位点的主胺和谷氨酰胺位点结合，从而导致不溶性和蛋白水解抗性的高分子量复合物形成的反响。已有报道，体外及原位的组织谷氨酰胺转移酶均可使多胺与tau结合。多胺化不影响tau与微管结合的能力，但可降低tau被钙活化的中性蛋白水解酶Calpain降解的敏感性。从AD脑内别离的PHF对组织谷氨酰胺转移酶免疫反响阳性，说明该酶可能在PHF形成中起重要作用。体外实验证明，组织谷氨酰胺转移酶处理的重组人tau可形成丝状结构。可见，tau蛋白以多种异常修饰参与AD的发病过程图4。因此积极干预tau的这些异常改变对AD以

59、及其他神经原纤维变性疾病有重要的指导意义。图图4痴呆发生的tau蛋白异常学说 PHF 双螺旋丝，NFT 神经原纤维缠结，HMW-MAP 高分子量微管相关蛋白早老素与AD早老素presenilin，PS包括PS-1467个氨基酸和PS-2488个氨基酸，两者高度同源，均为含有10个疏水区的8次跨膜蛋白质，亲水的氨基端和羧基端位于细胞质中。PS参与细胞内钙信号途径的调节，如调节-连环素-catenin的稳定性、膜蛋白的运输和钙依赖性性凋亡等。约5080%家族性AD与PS-1和PS-2基因突变有关，PS可能通过调节-分泌酶对APP切割以及通过Notch、Wnt信号转导途径影响tau的磷酸化而在AD样

60、病理过程中起作用。 PS与APP的代谢 含PS基因突变的家族性AD患者血浆A浓度升高，并在脑中出现A沉积，动物水平和细胞水平的实验也证实PS突变能促进A的生成，并以A1-42增高为主。APP与PS-1和PS-2共沉淀，与PS-1共沉淀的APPC99/C83片段恰好是分泌酶的作用底物。这些都提示PS可影响APP的代谢。其可能机制如下：PS作为分泌酶直接切割APP 在PS的第6和第7跨膜区上有两个保守的天冬氨酸位点，突变任一位点或者使用天冬氨酸蛋白酶抑制剂都会改变PS在两者间的环状结构而活性丧失，提示PS本身可能就是天冬氨酸依赖型的蛋白水解酶。当分泌酶的抑制剂L-486或CBAP 被用作特异的光和