主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第七章 放射免疫分析

1、 PAGE PAGE 5 / 4第七章 放射免疫分析第一节 放射免疫技术放射免疫分析是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性和抗原抗体反应特异性相结合的一种免疫技术。早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析（RIA） ，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析（IRMA）。一、基本类型及原理1、放射免疫分析（RIA）中抗原量的一种分析法。2、免疫放射分析（IRMA）体的非竞争放射免疫分析法。二、常用的放射性核素放射免疫技术常用的放射性核素有125、131、3H、14C 等。使用最广泛的是 125。三、标志物制备及鉴定采用放射性碘（如 125）酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。

2、1、直接标记法125物分子中酪氨酸残基或组胺残基上。（一）标记及类型其特点是标记方法操作简便，容易将较多的125志物。常用的方法为：氯胺T（ch-T）法；乳过氧化物酶标记法。2、间接标记法也称连接标记法（Bolton-Hunter 法） ，是最常用的间接碘标记方法。该法主要用于甾体类化合物、环核苷酸、前列腺素等缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。（二）标志物的纯化纯化标志物的方法有利用分子筛机制的凝胶过滤法、利用游离125与标志物分子极性差异进行吸附解 酰胺凝胶电泳法以及高效液相色谱法。（三）标志物的鉴定1、放射化学纯度是指单位标志物中结合于被标志物上的放射性占总放射性的百分率，一般要求大于9

3、5%。2、免疫活性指制备的标志物与抗体结合的能力。3、比放射性Cig、mCimgCimmol比放射性计算方法有计算法和自身置换法。四、抗血清鉴定抗血清的质量直接影响分析方法的特异性和灵敏度。用于鉴定抗血清质量的参数主要有以下几项：1、亲和性是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的结合强度，常用亲和常数Ka 表示。2、特异性是指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力。3、效价是反映抗血清中有效抗体含量的相对参数，即抗血清稀释至能与抗原发生有效反应的最大稀释度。五、方法学评价为增强结果的可比性， 需对RIA 方法学进行评价。除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以

4、下指标：1、可靠性断方法的可靠性。平行性好者可靠。2、剂量-反应曲线3、高剂量钩状效应高剂量钩状效应（H00K 效应）是指当标本中被测物浓度超过线性范围上限时，所得结果反而降低或呈阴性的现象。第二节 放射免疫分析放射免疫分析（RlA） 是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，它具有高度灵敏性、特异性和精确性等特点，特别适用于激素、多肽等含量微少物质的超微量分析。一、基本原理经典RIA 是采用标记抗原和非标记抗原竞争性结合有限量特异性抗体的反应。二、实验方法及测定RIA 具体测定方法包括以下三个主要步骤：（一）抗原抗体反应根据RIA 原理，将未标记抗原（标准品和待测样品）、标记抗原和特异性抗体

5、加入反应试管中，在一定条件（温度、时间及介质pH）下进行竞争抑制反应。（二）分离结合与游离标志物RIA 反应平衡后，标记抗原与试剂抗体形成免疫复合物（B）。由于其含量极少，不能自行沉淀，因此需加入适当的沉淀剂才能将其彻底沉淀， 然后经离心使其与游离的标记抗原（F）分离。某些小分子抗原也可采用吸附法分离B 与F。目前RIA 常用的分离方法有以下几种：1、第二抗体沉淀法其原理是用RIA 反应中的试剂抗体（一抗）如豚鼠的IgG 免疫另一种动物（如羊），IgG 血清（二抗）RIAIgGB 和 相物连接，制成固相二抗，分离BF2、聚乙二醇（PEG）沉淀法PEGPEG 被广泛用于实验作沉淀剂。其优点是沉淀

6、完全、经济方便，但非特异性沉淀较多，且当温度高于30时，沉淀物易复 溶。3、PR 试剂法先将二抗与PEG 按一定比例混合成悬液后进行试验。是将第二抗体沉淀法和PEG 沉淀法沉淀原理相结合的方法。此法保留了两者的优点，节省了二者的用量，且分离迅速，简便。4、活性炭吸附法活性炭可吸附小分子游离抗原或半抗原，而大分子蛋白（如抗体和免疫复合物）则留在溶液中。抗原 抗体反应后，加入活性炭颗粒，使游离的标记抗原的标记抗原抗体复合物供测定。该法主要用于测定小分子抗原或药物的RIA。（三）放射性测量及数据处理分离、FRIA 实验方法及目的，测定游离标记抗原 。绘制标准曲线（），样品管以其测量或计算的反应参数，

7、 通过标准曲线即可查出相应的待检抗原浓度，目前已普遍采用计算机进行数据处理、自动绘制标准曲线和打印样 品抗原浓度。第三节 免疫放射分析免疫放射分析（IRMA）是在RIA 的基础上发展起来的放射性核素标记免疫分析。与经典RIA125I附剂对BFRIA，操作程序较RIA一、基本原理1、单位点IRMA反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，测定上清液的放射量。2、双位点IRMA二、IRMARIA1、标志物RIA 是以放射性核素标记抗原，抗原有不同种类,标记时需根据其理化和生物学特性，选用不同的放射性核素和方法。IRMA 则是标记抗体，为大分子蛋白，性质较稳定，不同抗体标记方法基本相同，标记抗体的比活

8、度高， 提高了测定的灵敏度。2、反应速率反应速率与反应物浓度成正比，IRMA 反应中，标记抗体为过量，且抗原抗体结合为非竞争性，故反应速率比RIA 快。3、反应原理RIA 为竞争抑制性结合，反应参数与待检抗原量成反比。IRMA 为非竞争性结合，反应参数与待检抗原浓度呈正相关。4、特异性IRMA 采用针对不同抗原决定簇的双抗体结合抗原，反应受交叉反应物的干扰，较仅用单一抗体的RIA者小，测定特异性较高。、灵敏度和检测范围IRMA 反应中，抗原与抗体属非竞争性，微量抗原能与抗体充分结合；RIA 中标记抗原和待检抗原竞争,与有限量抗体的结合不充分，故IRMA 测定的灵敏度明显高于RIA。 用于抗原含量较高标本测定时，结果也较RIA 好,IRMA准曲线工作范围较RIA126、其他RIA 所用抗体为多克隆性，因此对其亲和力及特异性要求较高，但用量很少；IRMA 为试剂过量的非竞争性结合反应对抗体亲和力的要求不及RIA，但用量大。RIA 可以测定大分子和小分子抗原，但IRMA 则只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。第四节 放射免疫分析技术的应用常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药