山大生化实验报告 实验十一 微量凯氏定氮法

1、 微量凯氏定氮法姓名：周超学号：201100140067班级：11级生命基地同组者：刘炳煜时间：2011年6月4日【实验目的】1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。2、学会使用凯氏定氮仪。【实验原理】凯氏定氮也称克氏定氮。样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。然后经强碱碱化使硫酸铵分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度，即可计算的样品之含氮量，若以甘氨酸为例，其反应式如下：TOC o 1-5 h zNH2CH2COOH+3H2SO4-2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)2NH3+H2SO4-(NH4)2SO4(2)(NH4

2、)2SO4+2NaOH2H2O+Na2SO4+2NH3t(3)反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行(如图1)，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。为了加速消化，可以加入CuS04作催化剂，及硫酸钾以提高溶液之沸点，收集氨可用硼酸溶液，氨与溶液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低，指示剂颜色发生改变，然后用强酸滴定，所用无机酸的量即相当于被测样品中氨的量，本法适用范围约为0.21.0mg/mL氮。凯氏定氮法常用于测定天然有机物(如蛋白质，核酸及氨基酸等)的含氮量。图1微量凯氏定氮蒸

3、馏装置【实验试剂】实验仪器1、微量凯氏定氮蒸馏装置2、100ml锥形瓶6个3、5ml移液管4、10ml量筒5、电炉6、铁架台7、酸式滴定管8、沸石实验材料1、牛奶2、浓硫酸3、K2SO4CuSO4混合物4、双氧水5、0.3mgN/ml的标准硫酸氨6、硼酸7、30%的NaOH溶液8、0.0093mol/L的HC1溶液9、甲基橙指示剂10、蒸馏水【实验步骤】1、将凯氏定氮仪器的装置仪器安装好。样品的消化：牛奶：水=1:1的样品2ml，加入4mlHSO，再加入200mg24KSOCuSO催化剂，加热，消化至消化液由褐色变淡直至淡黄色，冷却，加入244双氧水数滴，继续加热至消化液至浅蓝色，冷却定容至1

4、00ml,备用。2、空白的制备：样品部分换成水，其他的操作与操作2相同。3、仪器的洗涤：在蒸气发生器内加入5mL浓硫酸和2滴甲基橙，并加蒸馏水总量加至容器容积的2/3,接收瓶内加入5mL混合指示剂，加热；如果接收瓶内指示剂不变色则表明洗净，关闭电炉，在小漏斗内加入蒸馏水，打开止水夹，将水放入，将废液倒吸出。4、标准硫酸氮含量测定：接收瓶内加入5mL硼酸，反应室内加入1ml（NH）SO424（样品测定时，加入2ml样品），10ml30%Na0H溶液，加热；待混合指示剂变为淡绿色时计时3min，然后使液面离开冷凝管口约1cm，并用少量去离子水洗涤冷凝管口，继续蒸馏1min。然后用标准盐酸进行滴定，

5、平行测定三次。5、样品的测定：相同的方法测定，空白测二组，样品平行测三次。【实验结果】（一）实验数据1、标准硫酸铵含量测定组数消耗标准盐酸量（0.0093mol/L/ml第一组2.52第二组2.44第三组2.48平均值2.482、样品含量测定组数消耗标准盐酸量(00093mol/L)/ml第一组1.62第二组1.66第三组1.62平均值1.63空白滴定均为0数据处理1、标准硫酸铵含量测定计算消耗盐酸的平均体积为2.48ml标准盐酸的浓度为0.0093mol/L氮含量=2.48X10-3X0.0093X14X1000=0.323mg/ml0.323-0.300|0.,3002、样品含量计算消耗盐

6、酸的平均体积为1.63ml标准盐酸的浓度为0.0093mol/L氮含量=1.63X10-3X0.0093X14/2X50X100=0.530g/100ml蛋白质含量=0.530X6.25=3.313g/100ml【思考讨论】(一)结果分析本次实验结果比实际值(2.9g/100ml)偏大，原因可能是1、滴定操作导致的误差，在用标准硫酸铵进行滴定练习时，计算的含量比正常值大，因此可能是滴定不规范造成盐酸过量，导致误差。2、可能是盐酸长期暴露在空气中挥发，导致其实际浓度比原标定浓度偏小，最终导致滴定的盐酸体积大于实际的，最终导致蛋白含量偏高。3、微量凯氏定氮法测得的氮不全是蛋白质中的氮，也可能是牛奶

7、包含的其他物质中的氮，因此导致蛋白质含量偏高。4、本实验是根据含氮量间接求出蛋白质的含量，是根据蛋白质的平均含氮比值计算的，并不是本实验样品中蛋白质的准确含氮量。5、蒸气发生瓶里的液体酸度不够，在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。（二）注意事项1、定氮仪各连接处应使玻璃对玻璃外套橡皮管绝对不能漏气。蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。3、消化时，若有泡沫产生，则等泡沫消失后再使电压达到220V,否则泡沫太多，硫酸不能完全将样品消化。4、蒸馏时，一定要在蒸气发生瓶里加入沸石，防暴沸。沸石晾干后可循环使

8、用，每次开始蒸馏前一定要加入新的沸石。5、蒸馏时，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。6、蒸气发生瓶内的水装至2/3体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。7、蒸馏时，蒸气要均匀、充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸1min后关掉热源。&变为绿色后开始计时3分钟，然后使冷凝口离开液面1cm，用蒸馏水洗涤冷凝口，继续蒸馏1min9、对仪器进行洗涤时，要用蒸馏水洗三遍。10、滴定时，液体变微红，且30s不褪色即到达滴定终点。（三）思考讨论微量凯氏定氮法的