镜疟原虫技术(1)课件

1、 镜检疟原虫技术 2012.31主要内容血片制作与染色疟原虫形态与鉴别疟原虫镜检2血片制作与染色血片制作血片染色3血片制作（所需用具）载玻片75%的酒精棉球采血针记号笔 玻片盒 4血片制作（血膜的制作）用于检查疟原虫的血涂片有两种： 一种是将血液涂成薄膜状，称薄血膜；一种是将血液涂成圆盘形，称厚血膜。薄血膜上的血细胞要求平辅在玻片上面。5血片制作（取血方法） 采血部位以耳垂较为合适，也可在手指末端采血，婴儿可从拇趾或足跟取血。先用75%酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食指轻轻捻转耳垂边缘或夹住被检者手指尖稍下方，右手持消毒针，迅速刺入取血部位1-2mm，不宜过深或过浅。然后用左手

2、大拇指、食指和右手中指协同挤出血滴。7血片制作（血膜的涂制） 取洁净的玻片2张，1张作载片，1张作推片（具有光滑边缘），右手拇指和食指夹持推片侧缘中部，用推片左下角刮取血液4-5ul（约火柴头大小），再用该端中部刮取血液1-1.5ul（相当于1/4火柴头大小），将左下角的血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径0.8-1.0cm的圆形厚血膜（厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5-10个白细胞为宜）。用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片和推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持2535度夹角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。推制时速度要均匀，血滴大小、

3、推片与载片之间夹角大小及展开血膜的速度快慢等常影响血膜的厚薄。制成的薄血膜应在玻片上形成平铺的血细胞，细胞之间互相接触而不相互重叠。每张载玻片上分别做1个薄血膜和1个厚血膜。 8血片制作（标准血膜的位置） 10血片制作（血膜编号） 血膜制成后，立即用特种蜡笔或水笔于玻片面上写上受检者的号码，以防差错，待薄血膜干后再用铅笔于薄血膜中写上受检者的个人编号，依次顺序插入标本盒内。11血片制作（涂制血膜的注意事项 ）涂制血膜时，手指只能持载片的边缘，不能接触玻片表面，以免油污使薄血膜产生空白区以及厚血膜脱落。推片的边缘一定要平滑，才能使推出的血膜均匀一致。刚涂制的血膜要平放，干前勿倾斜，以免造成厚血膜

4、厚薄不均，厚处不易溶血和着色而影响检查结果。血膜让其自然干燥，切忌用太阳晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。12血片染色（常用染液的配制）吉氏染液的配制 吉氏粉 5.0g 甲醇 250ml 甘油 250ml14血片染色（吉氏染液的配制）将吉氏粉5g置于研钵中，加入少量甘油小心充分研磨，然后边加边磨，至250ml甘油加完研磨均匀为止，倒入500ml有塞容量瓶中。每次加入少量甲醇至研钵中，多次洗涤研钵中的残留液，洗净为止。洗液均倒入容量瓶中，再加入部分甲醇，塞紧瓶塞，摇匀，再加甲醇稀释至500ml的刻度为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，置于5560水浴中或温箱内24小时或室温内35天，多加摇动，即成原液

5、。15血片染色（吉氏染液染色方法）先用甲醇固定薄血膜，待干后进行染色。单张血片染色：用中性蒸馏水或PH值7.0-7.2 缓冲液1毫升，加入吉氏染液1滴，混合均匀后，滴在厚薄血膜上，染色20-30分钟，然后用清水轻轻将玻片上的染液漂洗干净，晾干镜检。成批血片染色：将已固定薄血膜的血片插入染色缸，倒入新配的2%吉氏染液稀释液（即2毫升吉氏染液加中性蒸馏水或PH值7.0-7.2 缓冲液98毫升稀释均匀而成），浸没厚薄血膜，染色30分钟后，向染色缸中注入缓冲液或自来水，直至溢出，除掉染液表面上的浮渣，将液色缸中残余的染液倾出，然后用水轻轻漂洗一次，干净后取出玻片，将血膜朝下，插于晾干板上，待干镜检。1

6、7血片染色（影响血片染色好坏的因素）染料溶剂的质量 染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。染液的新旧 新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1-2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。 染液稀释后使用时间 染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。18血片染色（影响血片染色好坏因素）染液

7、的稀释浓度与染色时间 染液的浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不明显或消失。 稀释和冲洗用水 为使厚、薄血膜着色较好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.0pH7.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。19血片制作与染色的注意事项载玻片使用前一定要清洁，否则会影响血片制作和镜检结果。厚血膜干燥时不要加热，否则会使疟原虫变形，影响镜检结果。配制母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。固定薄

8、血膜时，不要将甲醇接触到厚血膜，否则染色时厚血膜将不能溶血。冲洗染液时，水流要轻缓，不要冲掉厚血膜。20血片制作和染色（质量判定标准） 好：厚薄血膜均好，或薄血膜好，厚血 膜中。中：薄血膜中，厚血膜好或中。差：薄血膜差，或厚薄血膜均差。21血片制作和染色(质量规范)22薄血膜中常见的血液成分中性白细胞酸性球血小板大单核球淋巴球红血球24薄血膜中常见的血液成分25核 即细胞核或染色质粒。在正常情况下核呈鲜红色，呈圆形或不规则的颗粒状。核的结构致密，只有在个别发育阶段较为疏松，例如间日疟原虫雄配子体的核。有时因胞浆厚密或染色深蓝，使核呈暗红或紫红色。疟色素 不着色，颜色和颗粒的形状，因疟原虫种类而

9、异。间日疟原虫的色素颗粒呈短棒状，黄褐色；恶性疟原虫的色素颗粒呈细砂状，黑褐色；人体疟原虫的基本结构27薄血膜中疟原虫形态与鉴别被寄生的红细胞核胞浆空泡疟色素薛氏小点核28红细胞 被间日疟原虫寄生的红细胞胀大、颜色变淡。疟原虫发育至阿米巴样体，红细胞出现薛氏点(Schuffners dots)。 被恶性疟原虫寄生的红细胞大小正常或稍微缩小，红细胞上有时见到茂氏点(Maurers dots)。疟原虫寄生的红细胞29间日疟早期滋养体-环状体 约占寄生红细胞的1/3，很少见到一个红细胞寄生2个环状体和一个环状体有2个核。 30 间日疟滋养体-大滋养体31间日疟裂殖体2.1 未成熟裂殖体 （immat

10、ure schizont）经40小时晚期滋养体发育成熟，虫体变圆，空泡消失核开始分裂又称裂殖体前期色素聚集成团块成熟裂殖体约有1224个 细胞核胞浆也随之分裂受染RBC 胀大、颜色苍白、虫体几乎充满红细胞32 间日疟原虫雌雄配子体3334恶性疟原虫-环状体环纤细可见数粒，大小不一，红色粗大的茂氏点核1个，但2个常见，红细胞常含2个以上原虫虫体常位于红细胞的边缘 ，呈“鸟飞状”35恶性疟原虫大滋养体 一般不出现在外周血虫体小结实，圆形，不活动疟色素集中一团，黑褐色原虫此时开始集中在内脏毛细血管36恶性疟成熟裂殖体 裂殖子836个，通常1824个，排列不规则疟色素集中成一团虫体占红细胞体积的2/3

11、至3/4 37恶性疟原虫雌配子体新月形，两端较尖核致密，深红色，常位于中央疟色素黑褐色，分布于核周围38恶性疟原虫雄配子体腊肠形，两端钝圆胞质色蓝而略带红核疏松，淡红色，位于中央疟色素黑褐色，小杆状，在核周围较多 39薄血膜中疟原虫形态与鉴别各种疟原虫各期形态鉴别疟色素颗粒鉴别大滋养体与大配子体的形态鉴别裂殖子与血小板的形态鉴别40各种疟原虫各期形态鉴别被寄生的红细胞形态大小及染色深浅度（是否褪色）；胞浆色彩及其浓淡，结构疏密，有否空泡及不着色带，体积大小；色素斑点（薛氏点、茂氏点）；查其他各期形态是否存在作参考；色素颗粒的形态、颜色、排列。对于这一点应掌握，尤其是厚血膜更为重要。否则在形态鉴

12、别上会混淆弄错。41疟色素颗粒鉴别与原虫在同一水平面；有立体感；色泽特殊，只有单色（色泽与背景色有关，须将视野放暗些）；形状如米粒状、沙粒状、颗粒状、短杆状，细粒可凝聚成堆。42大滋养体与大配子体的形态鉴别大滋养体：大小一般不超过被寄生的红细胞的3/4。核一个或延长呈带状，周围不着色带不明显。胞浆边缘不整齐，有时有空泡。在厚血膜上表现有活动性，故形态变化很大，胞浆收缩不均匀，有时断裂成团块，疟色素分布凌乱。大配子体：大小几乎充满真个红细胞。核一个，较紧密，常偏于一侧，周围有一圈不染色带。胞浆边缘整齐，无空泡。疟色素平均散在分布。在厚血膜上则体形较小，胞浆收缩均匀，不染色带明显，疟色素分布规则沿

13、边分布。43裂殖子与血小板的形态鉴别血小板：由骨髓巨噬细胞成熟脱落后解离而成，因此结构松散，严格地说不是个完整细胞（无核）。在吉氏染色中多见显淡红色或淡紫色，中间颗粒为紫红色，形状近似石榴子，且边缘不甚光滑。裂殖子：由成熟裂殖体破裂逸出，以致类似血小板聚集一起，或单个、或三五成群，但形体较血小板小，直径0.7-1.8微米。核较大，相对的难见到胞浆，核染深红色或紫红色，四周胞浆围绕，染蓝色，呈卵园形，边缘光滑。如附近查有疟色素颗粒是有力的佐证。44厚血膜中疟原虫形态与鉴别 厚血膜由于用血量多，细胞重叠，干燥缓慢，以致虫体皱缩，空泡消失，胞质变形，加之红细胞溶解，所以虫种和虫体的鉴别比薄血膜困难4

14、5厚血膜鉴别要点在厚膜中必须根据疟原虫的核、胞浆、疟色素三个条件鉴别是否是疟原虫及何种虫种。在一般情况下，具备三条中的二条也能给以判定。有时因染色较浅，不见原虫的核和胞浆，只见到典型的疟色素可断定。仅见到核和少许胞浆，或者因染液过偏酸性连胞浆也看不清楚，同时又不见色素，但是只要对被染血膜的颜色、红细胞的残影、疟原虫所处的背景加以综合分析，仍可正确做出判断。4647杂质与疟原虫的鉴别疑似疟原虫核与疟原虫的鉴别疑似疟色素与疟原虫的鉴别疑似疟原虫胞质与疟原虫的鉴别48疑似疟原虫与疟原虫核的鉴别细菌尤其是球菌或白细胞破裂后散出的颗粒，皆为红色小点，最易混淆。但球菌形体较大，边缘光滑，常多见聚集一处，分

15、布较广。嗜中性和嗜酸性粒细胞颗粒，着色较淡，边缘整齐，附近常有白细胞的碎屑。49疑似疟色素与疟原虫的鉴别 血膜上的染料残渣及灰尘，有时被误认为疟色素，可依据颗粒的大小，色泽及分布范围加以区别。转动显微镜微调时，可见其浮于红细胞上，与疟原虫不在一个平面。50疑似疟原虫胞质与疟原虫的鉴别网织红细胞残留物和白细胞残留物通常为蓝色，与疟原虫的胞质相似，如与某些红点结合在一起，易被误认为是疟原虫。鉴别时如形同大滋养体，可依据疟色素的特点加以区别；如形状似小滋养体，可依据虫体大小、折光是否均匀以及核与胞质是否在一个平面上予以区别。5152四种疟原虫图谱53间日疟原虫形态54恶性疟原虫形态55三日疟原虫形态

16、56卵形疟原虫形态57血片镜检（要点）在学习镜检疟原虫之前，必须首先对正常厚薄血膜中各种血细胞的形态、内部结构和染色性质加以识别。镜检疟原虫，首先看薄血膜，在基本掌握薄血膜中疟原虫形态后，再学习镜检厚血膜。镜检疟原虫一般只查厚血膜，薄血膜只作为原虫分类时参考和血片编号之用。镜检疟原虫须用油镜头配合5低倍目镜镜检，当发现疑难问题时，再调换10目镜进行观察。检查时应从厚血膜的上缘开始，从上而下，从左到右，一行接一行，一个视野稍叠一个视野顺序地看完整个厚血膜。一般情况下，每张厚血膜应观察至少100个视野或检查时间不少于20分钟。58血片镜检（结果记录）看完血片后，若为阳性，应立即按血片编号登记原虫的

17、种、期，以防差错。为检查后记录结果方便，对疟原虫的种、期可使用英文字母缩写作为代号。间日疟 P.v恶性疟 P.f三日疟 P.m卵形疟 P.o环状体 R大滋养体 T裂殖体 S配子体 G 59血片镜检（原虫密度计数）半定量计数厚血膜的疟原虫计数薄血膜的疟原虫计数60 国内常用此方法将密度分为6级：全厚血膜查见疟原虫数在10个以内，记录实际数字全厚血膜查见疟原虫数在10个以上，但平均每个视野不到1个虫，记录“少”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野15个，记录“”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野610个，记录“+”；100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野11100个，记录“+ ”；

18、100个视野中查见的疟原虫数平均每个视野100个以上，记录“+ ”。原虫密度计数（半定量计数 ）61原虫密度计数（厚血膜的疟原虫计数） 在制作厚血膜的同时，计数每l血中白细胞数。然后镜检厚血膜，计数每个视野中的疟原虫数和白细胞数，疟原虫密度较高时计数100200个白细胞即可，密度很低时计数1 000个。用下式算出疟原虫密度。疟原虫数 白细胞数 每l血中白细胞数 = 疟原虫数/l血。如果无法进行白细胞计数，则以6 000个白细胞 / l 血计算。62举例假设计数200个白细胞中有35个疟原虫，在不知患者白细胞数的情况下，以每微升血6000个白细胞计数，由此计算出每微升血液疟原虫密度为35（原虫数）200（白细胞数）6000=1050/微升答：该患者原虫密度为1050/微升原虫密度计数（厚血膜的疟原虫计数 ）63原虫密度计数（薄血膜的疟原虫计数 ）在涂制薄血膜的同时，计数每l血液中的红细胞数，也可按男性500万个、女性按450万个/l血计算。镜检薄血膜，算出红细