内含子对真核基因表达调控的影响

1、学号：20125072005湖北大学学年论文（课程设计）学 院：生命科学学院专 业年 级姓 名：徐振良论文（设计）题目：内含子对真核基因表达调控的影响指导教师：职称：成 绩：2016 年 1 月 8 日目录 TOC o 1-5 h z 摘要: 1关键词: 1 HYPERLINK l bookmark10 o Current Document 1 真核 mRNA 内含子的特征和剪接机制 1 HYPERLINK l bookmark12 o Current Document U2-型内含子的特征及剪接机制1 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document U12

2、 -型内含子的特性及剪接机制2 HYPERLINK l bookmark16 o Current Document 真核 mRNA 内含子对基因表达调控的影响 22.1真核mRNA内含子对转录的促进作用2 HYPERLINK l bookmark18 o Current Document 2.2内含子剪接与其它pre-mRNA加工事件的相互作用3 HYPERLINK l bookmark20 o Current Document 2.2.1内含子剪接与5端加帽3 HYPERLINK l bookmark22 o Current Document 2.2.2 内含子剪切与加帽的区别3 HYPER

3、LINK l bookmark24 o Current Document 2.3真核mRNA内含子对下游mRNA新陈代谢的促进作用3 HYPERLINK l bookmark26 o Current Document 内含子的作用部位3 HYPERLINK l bookmark28 o Current Document 内含子对翻译的促进作用4mRNA 监视4 HYPERLINK l bookmark30 o Current Document 展望 5 HYPERLINK l bookmark32 o Current Document 参考文献 5内含子对真核基因表达调控的影响摘要:大多数真核

4、基因都含有非编码的间隔序列内含子，根据剪接机制的不同，可将内含子分为 3 类:真核 mRNA 内含子、自我剪接内含子和真核 tRNA 内含子。在多数情况下，真核 mRNA 内含子的存在可以提高基因的表达水平，因 为其剪接过程会影响mRNA新陈代谢的多个阶段，包括转录、RNA编辑、pre-mRNA 的加工、mRNA的出核运输、翻译和无义衰变等。真核mRNA内含子在真核生物基 因表达调控中起着重要的作用，是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之 一。就真核 mRNA 内含子的特性、剪接机制及其对真核基因表达调控的影响作一 概述。关键词:内含子关键词:内含子剪接基因表达调控真核生物基因的一个基本特

5、征是它们被一个或多个内含子所间隔，这些间隔 DNA 在转录后被除去以形成具有完整读码框的mRNA，这一过程叫做内含子的剪接。 根据剪接机制的不同，可将内含子分为 3 类:真核 mRNA 内含子、自我剪接内含子 和真核 tRNA 内含子。真核 mRNA 内含子最初被认可的功能主要有 2 种，一是通过 外显子的复制和移动简化新基因的进化历程；二是通过可变剪接由单基因表达多 种蛋白，丰富了蛋白的多样性。1 真核 mRNA 内含子的特征和剪接机制U2-型内含子的特征及剪接机制随着基因组测序计划的进行，人们发现大多数的真核基因都含有内含子，并且 主要是真核mRNA内含子。真核mRNA内含子有两种类型:U

6、2-型内含子和U12-型 内含子，U2-型内含子存在较为普遍，占总数的99%，而U12-型内含子含量较少 (0.4%)U2-型内含子的 5/剪接位点 splicingsite,5，ss)具有 AG/GTAAGT 的保守序列，3剪接位点具有TGCAG/G(3/ splicingsite, 3 ss)的保守序列 (图1)。分支点位于3 ss上游大约2030nt处，序列并不保守，一般含有一个 腺苷酸，突变或缺失腺苷酸会降低剪接的效率或导致 pre-mRNA 无法剪接。脊椎 动物内含子分支点下游还有一段多聚嘧啶序列，是其他生物内含子不具有的。植 物内含子的一个显著特点就是富含 UA 序列， UA 序列

7、均匀的分散在整个内含子当 中，对于保证剪接的保真度和精确性起着关键的作用。U2-型内含子的剪接包括 两步连续的转酯反应: 第一步，分支点腺苷酸的 2 -OH 亲核攻击 5剪接位点的 磷酸集团，产生套索状中间物和自由的 5端外显子。第二步 5外显子的羟基 亲核攻击 3剪接位点的磷酸二酯键，去除套索状的内含子序列，同时将相邻的 两个外显子连接起来。整个剪接反应由一个巨大的核糖核蛋白体(RNP)-剪接体 (spliceosome) 介导。剪接体的装配是高度有序和动态的反应，包括 RNA-RNA，RNA-蛋白，蛋白-蛋白之间的相互作用。在剪接过程中RNA结合蛋白，RNA解旋 酶，蛋白激酶等多种蛋白因子

8、参与其中，保证了外显子、内含子的序列被有效的 区分，5 ss和3 ss被正确的选择。U12-型内含子的特性及剪接机制虽然U12-型内含子含量较少，但是在植物、哺乳动物、昆虫的核基因组中 均有发现。第一个发现的U12-型内含子是以AT双核苷酸开始,A双核苷酸结束， 所以U12-型内含子又被称为AT-AC型内含子。后来发现U12-型内含子也有GT-AG 型的，此外还有一小部分边界并不规则。U12-型内含子5 -ss(G/ATATCCTY)和 分支点(TCCTTRAY)序列高度保守，而3 ss序列的保守性稍差(YAC/G)，与分支 点之间距离大约为1020nt。植物U12-型内含子也富含UA序列，与

9、U2-型内含 子相似。U12-型内含子的剪接体包括5个小的核糖核蛋白组分。除了与U2型相 同的U5snRNP外，其它4种组分分别为U11，U12，U4atac, U6atac，与之对应 的U2型内含子剪接体组分为U1, U2, U4和U6,虽然这些组分的序列不尽相同， 功能位点却十分保守。值得注意的是,GT-AG型内含子经常被U12型剪接体剪接， AT-AC 型内含子也可以被 U2 型剪接体剪接，可见是内含子的整个序列，而不只 是边界序列决定到底是哪一种剪接体起作用。至今为止，只对极少数的U12型内 含子进行了研究。Lewandowsk等分离了拟南芥CBP20, GSH2和LD基因的内含子，

10、并对 3 个内含子的剪接位点、分支点、 UA 含量进行了突变分析，结果显示 U12 型内含子的剪接依赖于一系列要素，包括UA含量、邻近的外显子序列、ESEs(Exon Splicing Enhancer sequences) 等，各要素都会影响其剪接效率。2 真核 mRNA 内含子对基因表达调控的影响许多基因如0 -球蛋白、胸腺激素合成酶、嘌吟核苷磷酸化酶基因当以cDNA形 式存在时，表达效率极低，而当有内含子存在时，表达水平会大大提高。在线虫、 昆虫、哺乳动物、植物中都发现内含子的存在对基因表达有着积极的作用，内含 子已经成为提高外源基因表达的重要元件。下面就真核mRNA内含子对基因表达 调

11、控的影响作一综述。2.1真核mRNA内含子对转录的促进作用许多基因中的内含子都可以刺激转录的效率，如转基因鼠的转录效率会因内含 子的去除而降低100倍，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基化转移酶(PAT 1)基因的两个内 含子都可以提高报告基因的转录效率，进而提高报告基因的表达。在DNA水平上, 内含子以 2种方式影响转录。一种方式是通过内含子序列本身含有的转录增强元 件或抑制元件。目前在许多基因的内含子中都发现了转录调控元件，其中大多为 增强元件。Chang等发现猪的MyHC(Myosin Heavy Chain)基因内含子中存在转录 调控元件，可以通过调控转录的起始来增强基因的表达。内含子影响转录的另

12、一 种方式是通过调节核小体的位置来控制DNA的可接近性。在对转基因鼠的研究中 发现鼠生长激素基因的内含子可以通过促进核小体靠近启动子的有序排列来刺 激转录。最近研究表明RNA聚合酶II的CTD(C-terminal domain)在pre-mRNA加 工中起着重要的作用，CTD既是转录和pre-mRNA加工的平台，又是它们的调节 子。UlsnRNA是剪接体的重要组分，可以与转录起始因子TFIIH相互作用，进而 增强RNA聚合酶II的转录起始能力。另外，内含子内部的剪接信号可以通过与3 种转录延伸因子相互作用增强RNA聚合酶II的持续合成能力。转录延伸因子 pTEFb能够磷酸化CTD的丝氨酸(S

13、er)位点，在装配一个新转录的内含子时,pTEFb 集合TAT-SF1、AT-SF1与剪接因子相互作用，调节剪接复合体的装配，被TAT-SF1 结合的剪接复合体可以强烈的刺激转录。最近发现，pTEFb还可以磷酸化另一个 转录延伸因子hSPT5,转录延伸因子TFIIS也可与RNA聚合酶II的复合体、剪接 因子等相互作用。2.2内含子剪接与其它pre-mRNA加工事件的相互作用除了内含子的剪接，pre-mRNA的加工事件还包括5端的加帽，3端的裂解和 多聚腺苷酸化作用，RNA编辑等。这些加工事件对基因表达调控至关重要，虽然 是被独立发现的，但在时间和空间上却是相互偶联的。2.2.1内含子剪接与5端

14、加帽在RNA聚合酶刚刚合成2030nt后，聚合反应暂停，通过一个3步反应将帽(cap) 结构加入到 pre-mRNA 的 5端。许多实验都证明了加帽对剪接的促进作用。把 含有多个内含子的pre-mRNA加入到在核抽提物中，发现帽子结构可以增强帽子 近端第一个内含子的切除，但对第二个内含子的剪接效率影响不大。帽结合复合 体(cap-bindingcomplex)可以促进UlsnRNP与5剪接位点之间的作用，通过加 强U6对UlsnRNP的替换，促进剪接的进行。通过酵母双杂交系统筛选得到可能 介导CBC与剪接体相互作用的蛋白因子HnRNPF，HnRNPF可以特异性地与CBC亚 基相互作用，去除Hn

15、RNPF的抽提物剪接效率明显下降。内含子剪切与加帽的区别内含子剪接与3端形成与5加帽不同的是，mRNA3末端的形成与内含子剪 接之间的作用是相互的。体外研究发现，上游的3剪接位点可以有效增强下游 多聚腺苷酸化的效率，而3 polyA尾巴也会促进3 ss的识别，两者之间的促 进作用会使mRNA的累积量大大增加。这些反应的分子基础是剪接因子与多聚腺 苷酸化作用因子之间的直接作用。另外，剪接还会影响PolyA位点的选择，导致 不同基因产物的产生。如在IgM基因中，内含子内部相对较弱的PolyA位点会由 于U1-70K的作用而受到上游5剪接位点的抑制，产生含有内含子的的转录本。2.3真核mRNA内含子

16、对下游mRNA新陈代谢的促进作用2.3.1 内含子的作用部位内含子对mRNA运输的促进作用内含子的剪接与mRNA的输出虽然发生在细胞的 不同部位，但这两个过程却是直接相关的。以前曾有报告指出cDNA转录的mRNA 不能出核，因此不能够表达蛋白，而包含有内含子的mRNA转录本可以有效的输 出而被翻译，说明内含子对 mRNA 的出核运输有促进作用。最近研究发现含有内 含子的转录本是由不同于cDNA转录本的促进出核的mRNP复合体所装配。mRNP 中剪接因子UAP56可以将输出因子Aly结合到mRNA上,ALY与mRNA出核受体TAP 之间相互作用，将 mRNA 运送到核孔处出核翻译。但是应该指出的

17、是虽然剪接可 以促进mRNA的输出，但是剪接并不是mRNA出核所必须的，因为许多运输因子都 可以独立于剪接而单独作用。本身不含内含子的转录本(组蛋白等)是靠本身含有 的特异序列与输出因子结合，不需要剪接体的协助。剪接体的另一作用是将未剪 接的转录本保留在细胞核中，促进成熟正确剪接的 mRNA 输出。剪接因子 hnRNP 将初级和部分剪接的转录本包裹起来保留在核中，mRNP/输出因子复合体将成熟 的 mRNA 带出细胞核。然而，在一些反转录病毒中，一些蛋白的表达往往需要非 转录或部分转录本的存在，这些病毒基因在内含子中通常包括与特异病毒或细胞 运输因子相互作用的顺式作用元件，所以能够打破核滞留。

18、内含子对翻译的促进作用Braddock等人发现当将成熟的mRNA直接注射入非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞核 中时，mRNA在细胞质中的翻译会受到抑制，这种抑制可以通过在3Z -UTR处加 入可剪接的内含子而消除，说明了内含子对翻译的促进作用。另外，剪接体剪接 结束后在外显子接头上游2024nt处沉积的EJC(exon junction complex)可以 增强核糖体与mRNA之间的结合。研究发现，将EJC组成蛋白Y14、Magoh、RNPS1 加 入到 无内含子的 转录本 中 ， 翻 译 的 效率会大大提高。 当 将参与 NMD(nonsense-mediated mRNA decay)

19、的 EJC 蛋白因子 Upfl、Upf2、Upf3b 加入 到报告基因ORF(Open Read Frame)的5端，翻译的产量、核糖体与mRNA之间 的结合大大增加，说明参与NMD作用的EJC因子不仅用于消除异常的转录本，在 翻译中也担当了新的任务。 Matsumot 等发现剪接对翻译的影响与内含子的位置 有关。当内含子置于5 -UTR时，翻译会被大大的刺激，而当内含子置于3 -UTR 时，翻译的水平会低于无内含子的水平。内含子识别、内含子对位置的依赖、内 含子对翻译的影响机理还不甚清楚。但是对于想要优化转基因生物表达的研究者 来说，必须关注内含子的位置，这是一个十分重要的元素。当内含子位于

20、表达核 的3 -UTR时，除了翻译的效率会降低外，甚至还会引起mRNA的无义衰变，导 致更低水平蛋白的表达。mRNA 监视内含子剪接与无义介导的mRNA(nonsense-mediated mRNA decay， NMD)无义介导 的mRNA衰变又名mRNA监视，是指选择性的降解含有早熟终止密码子(premature termination codons，PTCs)的mRNA，对转录后的mRNA进行质量控制。NMD广泛 存在于各种真核生物中，可以消除由畸变 mRNA 产生的截短的有害的蛋白。 NMD 的一个关键步骤是区分早熟的和正常的终止密码子。在哺乳动物中，如终止密码 子与下游外显子接头处间

21、距大于5055nt,则被认为是早熟的，相应的mRNA会 被降解。最近研究发现EJC包含与NMD作用的重要因子。在剪接因子RNPfl和蛋 白因子Y14的作用下，输出因子hUPF3结合到EJC上，这些因子伴随mRNA进入 细胞质，在细胞质中被翻译终止复合体所检测。在第一轮翻译后，这些蛋白因子 虽然从mRNA上剥去，利用特异的蛋白将mRNA降解，但是NMD复合体对入膜的正 确mRNA已经有了记忆功能，这就使核内剪接与膜中NMD之间建立起了直接联系。3 展望随着分子生物学的发展，越来越多的证据显示，真核mRNA内含子在真核基因表 达调控中起着重要的作用。在单子叶植物中，玉米adhl和sh1内含子使转基因 玉米报告基因的表达水平提高10100 倍。在双子叶植物中也观察到了内含子增 强表达的现象，但是这种增强幅度较小，一般为 25倍。实验室将玉米泛素蛋白 基因 ubiquitin 的内含子 ubi 插入到具有自主知识产权的 Bt 杀虫基因 cry1