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文档简介

1、PBMC分别培养和办理步骤PBMC分别培养和办理步骤3/3PBMC分别培养和办理步骤刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）从前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。3.加样：取50ml离心管，吸取6mlFicoll（淋巴细胞分别液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。4.离心：18-20,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。

2、5.回收：将移液管直接插入云雾层（也许先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。6.冲洗：加入最少于18-20,2000rpmPBMC，10min（外周血单个核细胞），两次。体积3倍的PBS，7.细胞计数：弃上清，加1mlRPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。专用仪器测定：吸取必然量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。细胞数/ml=4个大方格细胞总数/41042（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。（我们平时是培养过夜后再进行下一步办理）。9.搅乱素办理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的-IFN（搅乱素），同时设比较组，时间为8小时。（家族性乙肝、丙肝患者中严禁备抗病毒治疗者省去搅乱素办理的步骤。10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次

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