原核表达及纯化总结

1、His标签重组蛋白大量表达及纯化一筛选及鉴定1将构建好的连接产物进行转化DH5a鉴定表达载体和目的片段的连接一般为IOrL连接体系，此步转化方法如下： 取1OO|1LDH5（X感受态细胞，加入到IOrL连接产物体系中冰上放置30min42c准确热激90秒冰上放置3min加入300pL无Amp+的LB培养基，37 100rpm/min振荡培养lh将400|iL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置3。min待菌液完全吸收后，在37c温箱中倒置培养过夜（1216 h）,直至出现单菌落。2阳性克隆的PCR鉴定方法如下挑取单菌落于200|iL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管），摇床200rp

2、m/min, 37培养4h,待菌液浑浊后，取IpiL做菌液PCR鉴定。PCR扩增体系如下：取1 pL菌液作为模板反响体系如下： TOC o 1-5 h z 模板1pLlOxPCR反响缓冲液(含Mg2+ )2pLdNTP(2.5 mmol/L/each)1.6pL上游引物(10|amol/L)1pL下游引物(10|amol/L)1pLTaq 酶(5U/|L)0.3pLddH2O13.1pLTotal20pL条件:94预变性lOmin94c变性45s50c退火45s72c延伸Imin, 30个循环的扩增反响72c延伸10min4oo1%琼脂糖凝胶电泳检测：电泳上样时：Marker DL2000上样

3、3pL样品（1 （jL loadingbuffer +6jjL PCR 产物混匀上样）100V, 20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。 （注意：记得保存菌种）3阳性克隆质粒抽提取阳性克隆菌液200匹，加3ml含Amp+LB液体培养基，37 200rpm/min培养3-4h, 待菌液浑浊后，进行质粒抽提。质粒抽提方法如下：取1.5mL菌液于1.5mL离心管中I12000rpm离心30s,弃上清I加800AL STE悬浮沉淀12000rpm离心30s,弃上清重复STE漂洗沉淀的过程加入100匹 预冷的solution I ,强烈振荡混匀温和加入200pL solution

4、II （solution II现用现配），盖紧管口快速颠倒5次，放置冰上2 min至溶液清亮而粘稠I极温和加入150|iL预冷的solution III,倒置温和振荡10s,冰上放置5 minI12000rpm 离心 5 minl取上清（400L）,加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）,振荡混匀12000rpm 离心 5 min取上清（350.L）,加入 1/10 体积（35.L）的 NaAc （3M）和2倍体积预冷的无水乙醇（700|iL）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20c保存）室温放置20min （-20沉淀效果更好）13000rpm 离心 10 min弃上清（小心倒出），用1ml

5、 70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀13000rpm 离心 lOmin室温放置让乙醇挥发干净用20（JTE溶解质粒DNA,每20|iL体系中加入IpiL Img/mL的Rnase, 37作用30min, 1%琼脂糖电泳定量检测纯度所用试剂：1、STE： O.lmol/L NaCL1 Ommol/L Tris-HCL(pH8.0)1 mmolol/L EDTA2、solution I ： 50mmolol/L Glucose25mmolol/LTris-HCL (pH8.0)lOmmolol/L EDTA(pH8.0)3、solution II ： 0.2mol/L NaOH1%SDS4、soluti

6、on III：5mol/L KAc60mL冰醋酸11.5mL无菌水28.5mL(最终K+的浓度为3mol/L, Ac-的浓度为5mol/L)4 BL21的转化及诱导表达质粒转化BL21感受态细胞方法如下：取100|jLBL21感受态细胞，加入IrL质粒I冰上放置30minI42准确热激90秒冰上放置3min加入900mL无Amp+的LB液体培养基，37 100rpm/min振荡培养lh取IOOlL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后， 在37温箱中倒置培养过夜（1216 h）,直至出现单菌落。5目的蛋白的诱导表达挑取单克隆菌落于3ml的LB液体培养基（含Amp+

7、）中180rpm/min, 37c培养。待菌液浓度0口6（沪0.6时开始诱导：首先取出501dL菌液留样1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 3rL30 180rpm/min 诱导 4h 收菌6目的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定.取700|iL菌液13000 rpm离心Imin,弃上清.空菌对照及marker.力30|iLPBS和30|iL2xSDS上样缓冲液，用枪吹匀.沸水煮lOmin,稍离心，将液体汇聚管底，取10|uL上样12%的胶浓缩胶90V 10min别离胶160 V 50min考马斯亮蓝染色30min脱色液脱色二大量诱导表达.取300nL菌液，加入到50mL LB液体培养

8、基（含Amp+）中180 rpm/min 37过夜.将50ml菌液全部加入到500ml LB液体培养基（含Amp+）中200rpm/min, 37,大约2h左右，止匕时OD6oo约等于0.6开始诱导. 1:1000向剩余菌液中加0.8M的IPTG 550（iL诱导条件：30 180rpm/min诱导时间:4h收菌（取700|iL留样电泳分析，是否表达出来及表达位置和表达量）三细胞裂解.将550ml菌液，收菌前准确称出瓶中（为计算湿菌重量）.分三次，4800 rpm/min离心20min,在用PBS洗涤一次，倒置用滤纸控干.称全重，计算出湿菌重量.每克湿菌加 5ml Lysis buffer （

9、Tris： 50mM Nacl： 300mM PH:8.0）混匀转移到50ml管内.每毫升菌液加1:500加0.1M PMSF.加入终浓度为lmg/ml的溶菌酶E,玻棒搅动20min. -80 反复冻融3-5次（冰水混合物中融化）. 每克湿菌加4mg脱氧胆酸（脱氧胆酸先用1ml Lysis buffer溶解），取样30pL准备电泳 分析（玻璃棒37水浴中搅拌30min,此步骤假设是不可溶性蛋白可这样处理，假设是可容性蛋 白可在冰水混合物中搅拌）.用注射器在冰水混合物中反复吹吸，使菌液不再成团，变得更加粘稠.超声20min （每次超声不得超过30s）.加终浓度5|ig/ml的DNase I和RN

10、ase A及终浓度10mM 的CaCl2和MgCl2.室温摇床作用30min,注射器反复吹吸.补加一倍体积的Lysis Buffer,同时加终浓度为1%的曲拉通。（平时常温曲拉通储存液浓 度为20%,否那么不宜溶解）.反复吹吸. 13000rpm/min 20min.上清补加PMSF（1:5OO）沉淀用bufferB溶解同样补加PMSF（ 1:500）Buffer B：NaH2PO420mMNacl500 mMUrea 8M PH:8.0Buffer C:NaH2PO420mMNacl500 mMUrea 8M PH:6.8（不含咪噗，咪唾现用现加，终浓度10mM）咪唾2M （2M咪唾分装-2

11、0保存）Buffer D： NaH2PO4 20mM Nacl 500 mM Urea 8M PH:8.0（咪嗖终浓度 lOOmM）分析：上清及沉淀还有样品处理前的留样，进行电泳分析鉴定目的蛋白是可溶的还是 不可溶的以便选择纯化方式四 His标签蛋白纯化（可溶和不可溶性）可溶性蛋白纯化（上样前要将上清过0.22|im的滤膜）wash buffer平衡柱子（不含咪口坐）流速Iml/minwash buffer： NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:6.8 过滤 0.22（im 除气2）上样 流速0.3ml/min （注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次 流穿

12、液，（取样电泳）流穿液也再过一次柱子，接二次流穿液，留样电泳一般可溶性蛋白：过一次柱子就可以将目的蛋白完全吸附，这与柱子有一定关系，第 一次操作，最好将一次流穿液再过一便柱子。wash buffer （含20mM咪口坐）洗脱杂蛋白0.8ml/min,洗脱至少100mL直到蛋白吸 收曲线变平为止（取30匹 电泳分析）Elution buffer洗脱目的蛋白（含250mM咪嗖）Elution buffer： NaH2PO4 50mM Nacl 300 mM PH:8.0 过滤 0.22|im 除气流速0.3ml/min收集蛋白收集峰值 每管2mlwash buffer平衡柱子（不含咪唾）流速Iml

13、/min6）保存柱子时用20%酒精，47）对纯化的样品电泳分析纯度，紫外分光度法定量蛋白浓度（mg/ml） =1.45xOD280-0.74xOD260蛋白1:1000分别加入:0.1M PMSF0.5M EDTA 100 x0.5M EDTA 100 x0.5M EDTA 100 xPH:7.5 （即储存液为100 x,加入终浓度为lx）0.5M EDTA 100 x5M L-Arginine 100 xPH:7.5 （即储存液为100 x,加入终浓度为lx）分装-20保存不可溶性蛋白纯化1）沉淀用30ml buffer B溶解后，13000rpm离心15min上清过0.22|im的滤膜Bu

14、fferB平衡柱子（不含咪唾）流速Iml/minBuffer B NaH2PO4 20mM； Nacl 500mM； Urea 8M； PH:8.03）上样 流速0.3ml/min （注意蛋白浓度不宜过高，蛋白总量不得超过柱子载量）接一次流 穿液，（取样电泳）流穿液重复3-4次过柱子每次的流穿液都要留样电泳分析 不可溶性蛋白一般浓度较高，一次不能让柱子充分吸附，所以流穿液重复上样BufferC洗脱杂蛋白，流速0.8ml/min,洗脱至少100mL直到蛋白吸收曲线变平为止， 可用考马斯亮蓝G-250监测Buffer C NaH2PO4 20mM； Nacl 500 mM； Urea 8M； PH

15、:6.8 （含咪唾终浓度 10 mM）, 一般咪睡现用现加，配好的2M咪fl坐分装-20保存Buffer D洗脱目的蛋白（含100mM咪唾）流速0.3ml/minBuffer D： NaH2Po4 20mM； Nacl 500 mM； Urea 8M； PH:8.0（咪噗终浓度为 lOOmM）6）收集目的蛋白，收集峰值，2ml/管7）蛋白跑电泳分析，含目的蛋白的管子合在一起，透析复性。8） BufferB平衡柱子（不含咪哇）流速Iml/min9）保存柱子时用20%酒精，4不可溶性蛋白复性1）根据蛋白分子量大小，选择合适的透析袋水煮30min-lh2）检查透析袋是否漏，将蛋白装入透析袋中透析，透析每12h换一次透析液具体操作：6M Urea4M Urea2M Urearefblding buffer 1 refolding buffer 2一pbs 1 一pbs 2一pbs3一pbs4refolding buffer: 50mM Tris； pH 7.90.5mM EDTA50mM NaCl 5% glycerol磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液【配制方法】在 800ml 蒸储水中溶解 8g NaCK 0.2g KCL 1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2Po4,用 HC1 调节pH值至74 加水定容至IL,高压下蒸气灭菌20min,保存于室温。