组织裂解液和细胞裂解液的配制

1、组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液：150 mM NaCL1% NP-40 （去垢剂）0.1% SDS （去垢剂）2ug/ml Aprotinin （蛋白酶抑制剂）（使用前加入）2ug/ml Leupeptin （蛋白酶抑制剂）（使用前加入）1 mM PMSF （蛋白酶抑制剂）1.5 mM EDTA （蛋白酶抑制剂）1mM NaVanadate （磷酸脂酶抑制剂）（任选）以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。2、冷的PBS中加入1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （钒酸钠）（任

2、选）3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养 瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在 最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。2、 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75cm2培养瓶加1ml）.然后用细胞刮子沿着 瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一 瓶中继续刮（由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取）。3、 吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心

3、管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下 的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以 不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10 分钟，留取上清。5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计，在 A280测定），分装保存在-70C。4方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl （pH 8.0） 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF （苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L（100ng/ml）Pepstatin（

4、胃蛋白酶抑制剂）1 u mol/L（0.7 u g/ml）Leupeptin （亮抑制肽）0.5mg/mlAprotinin （抑蛋白酶肽）0.3 u mol/L（1 u g/ml）（注：PMSF贮存液：100mmol/L 即 17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml 溶于 0.01mol/LHEPES（pH8.0）;Leupeptin贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin贮存液10mg/ml于甲醇液中.均于-20C保存）裂解操作程序：*离心收集1X107个细胞*加入4。预冷1%NP-40裂解液100 Pl*剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀

5、浆）4C放置 1530min4。离心，15 000rpm,10min,取上清备用。方法三*细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2.溶解蛋白；3.蛋 白变性使其稳定；4.抑制蛋白酶活性推荐 RIPA buffer:.50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系150 mM NaCl等渗体系-1 mM PMSF强大的蛋白酶抑制剂1 mM EDTA变性剂和稳定剂5 Pg/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制剂5 Pg/ml Leupeptin蛋白酶抑制剂1% Triton x-100 破坏细胞1% Sodium deoxycholate中度变性剂和蛋白溶

6、解剂细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋 白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐 RIPA buffer:.50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系150 mM NaCl等渗体系1 mM PMSF强大的蛋白酶抑制剂1 mM EDTA变性剂和稳定剂5 pg/ml Aprotinin蛋白酶抑制剂5 Pg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂1% Triton x-100 破坏细胞1% Sodium deoxycholate中度变性剂和蛋白溶解剂0.1% SDS强变性剂和蛋白溶解剂其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，一20C保存

7、，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如 果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。*用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液（P0013），该裂 解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘 滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该 裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发 现Western及IP细胞裂解液（P0013）效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液（强、中或弱） 或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景

8、很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用 裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液（强或中）。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则 说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液（弱）或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western,如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可 以尝试使用裂解强度更高的裂解液，例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl，1.0% NP-40 或 Triton-x-100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。一、组织裂解液

9、配制组织裂解液配方：7MUrea(60. 06)4.2042 g2Mthiourea(76.12)1.5224 g100mMDTT0.1543 g4%CHAPS0.4g0.5mMEDTA0.00146 g40MmTris0.0485 g2%(v/v)NP-400.2 ml1%(v/v)Triton X-1000.1 ml5mMPMSF用前加0.00871 g2%pharmalyte0.2ml共10ml分装成400 u 1/每管(可应用于30-80毫克组织裂解)注：已配好分装成400 u 1/每管可供应用不需另配！细胞裂解液配方：6M Urea(60. 06)1.8018 g2M thioure

10、a(76.12) 0. 7613 g65mM DTT0.050 g4% CHAPS 0.2 g40Mm Trisbase 0.02425 g共5ml分装成200 u 1/每管(可应用于50-100m1培养瓶内的细胞裂解)细胞裂解液：组织裂解液配方：7 mol/L 尿素、7MUrea(60. 06)4.2042 g2 mol/L硫月尿、2Mthiourea(76.12) 1.5224 g2% NP-40、2%(v/v)NP-400.2 ml1% Triton X-100、1%(v/v)Triton X-1000.1 ml65 mmol/L DTT、0.1003g 100mM DTT0.1543

11、g5 mmol/L PMSF、5mMPMSF用前加0.00871 g4% CHAPS、4%CHAPS0.4g40 mmol/L Tris、40MmTris0.0485 g2% pharmalyte (pH3-10)、2%pharma1yte0.2ml0.5mM EDTA 0.00146 g25 mg/L DNase I、7 mg/L RNase A、20 mg/L aprotinin、20 mg/L leupeptin、2 mmol/L Na3VO4、Phosphatase Inhibitor Cocktail 1Phosphatase Inhibitor Cocktail 21ml水化液配方：8M Urea（60.06）0.48048 g2% CHAPS 0.02 g痕量漠酚兰0.4 U l1%的痕量漠酚兰（10mg+1000ul双蒸水）450 U l 水化液 力口 DTT 0.00135mgor 400 U l 水化液 力口 DTT 0.00126mg各种细胞裂解液的功用都分别是什么，SDS , NP-40 , TritonX-100有何作用SDS , NP-40 , TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得 很粘稠。NP-40是很温和