川芎嗪抗动脉粥样硬化机制的研究

1、川芎嗪抗动脉粥样硬化机制的研究【摘要】目的研究川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白(x-LDL)致人内皮细胞EV304损伤的保护作用及机制，讨论其在动脉粥样硬化防治中的意义。方法x-LDL诱导人血管内皮细胞损伤，以0.5g/l川芎嗪干预24h，试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶LDH)、丙二醛DA)含量以及细胞中超氧化物歧化酶(SD)、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px活性。结果川芎嗪对x-LDL诱导的血管内皮细胞诱导的损伤有明显的抑制作用，主要是显著进步了血管内皮细胞抗氧化酶SD、GSH-Px的活性。结论川芎嗪对x-LDL导致內皮细胞损伤具有保护作用，机制与其抗氧化效应有关。【关键词】川芎嗪；氧化型低密度脂

2、蛋白；动脉粥样硬化；谷光甘肽过氧化物酶；超氧化物歧化酶内皮功能不全被认为是动脉粥样硬化(atherslersis，AS)炎症学说发病机制中的最早期事件。许多危险因素能引起内皮功能不全，诸如高胆固醇血症、高血压并吸烟、糖尿病等1。但内皮功能不全确实切机制还不非常清楚。越来越多的证据显示氧化型低密度脂蛋白(xidizedldensitylipprtEin,x-LDL)在内皮功能不全中扮演重要角色。本实验以体外培养内皮细胞为研究对象，观察川芎嗪对x-LDL诱导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制，为川芎嗪在治疗动脉粥样硬化中的应用提供实验根据。1材料与仪器1.1药物盐酸川芎嗪氯化钠溶液100l80g，购

3、于山东华鲁制药，用蒸馏水稀释成终浓度0.5g/l。1.2细胞人内皮细胞株(EV304)购自武汉大学典藏中心。1.3试剂与仪器DE，胎牛血清以及胰蛋白酶购自美国Gibe公司；乳酸脱氢酶LDH)、丙二醛DA)，超氧化物歧化酶(SD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒均购于南京建成公司。兔抗人因子抗体购于福州迈新生物技术公司。2方法2.1内皮细胞培养和鉴定常规培养EV304细胞，待生长至交融状态后，0.25%胰蛋白酶消化，吹散、均匀接种于预置盖玻片的6孔板中，参加细胞培养液，置孵箱培养24h取出细胞爬片。PBS洗涤两次，4多聚甲醛固定后，细胞的鉴定采用因子抗原检测法、DAB染色阳性确定。

4、2.2x-LDL的制备参照文献2别离出人血浆LDL，4置磷酸缓冲盐透析24h，经琼脂糖凝胶电泳证实为单一区带。所得LDL经聚乙二醇(PEG)20000浓缩45倍后以Lrys法测定蛋白含量。0.45l/L滤膜过滤除菌。采用ul2在室温下氧化。测定各组硫代巴比妥酸反响产物TBARS值，经0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测LDL氧化程度。转贴于论文联盟.ll.2.3实验分组测定其它指标的细胞，无血清培养基同步化12h，随机分为组：空白对照组EV304：不加任何刺激因素；川芎嗪对照组EV304川芎嗪：参加终浓度为0.5g/l的川芎嗪；x-LDL组EV304+x-LDL参加终浓度为0.1g/l的x-LDL；川

5、芎嗪保护组EV304+x-LDL+川芎嗪参加终浓度为0.1g/l的x-LDL和0.5g/l的川芎嗪。各组细胞参加处理因素后继续培养24h，搜集细胞培养液，测定LDH、DA含量；搜集细胞检测SD、GSH-Px活性。2.4测定LDH、DA含量以及SD、GSH-Px活性搜集12孔培养板中培养液，按照试剂盒说明书测定LDH和DA含量；培养板中细胞用PBS洗2次，刮取细胞，参加冰冷PBS悬浮细胞，超声15s，反复冻融3次，离心，按照试剂盒方法测定SD、GSH-Px活性。3结果3.1内皮细胞第因子相关抗原免疫组化鉴定细胞呈椭圆形，多角形或不规那么形，胞浆中有黄褐色颗粒存在，因子相关抗原鉴定反响阳性。3.2

6、川芎嗪对x-LDL诱导内皮细胞损伤的保护作用细胞培养液中LDH检测说明：经x-LDL刺激24h后细胞分泌的LDH含量468.349.46U/L，明显高于未加任何处理因素的空白组136.5619.26U/L。而经过终浓度为0.5g/l的川芎嗪处理的药物保护组细胞分泌的LDH含量为75.346.89U/L，明显低于x-LDL组，两者差异显著P0.05。川芎嗪保护组较x-LDL组DA含量明显降低，差异有显著性P0.05，其中x-LDL组DA为1.580.02l/L，而川芎嗪保护组DA为0.640.08l/L；同时川芎嗪保护组的SD、GSH-Px活性明显高于x-LDL组，x-LDL组SD为27.435

7、.43U/L，GSH-Px为74.436.39kU/0.1L；川芎嗪保护组SD为40.436.52U/L，GSH-Px125.634.67kU/0.1L，两组差异显著P0.05。结果见表1。表1川芎嗪对x-LDL诱导内皮细胞损伤的保护作用略4讨论内皮细胞功能障碍是AS始发事件，而x-LDL是目前公认的致内皮细胞损伤的危险性因子之一。临床上发现急性心肌堵塞患者血浆x-LDL程度明显高于心绞痛患者和对照组，但三者之间的脂质程度无差异3。Tshia等发现冠心病(rnaryheartdisease，HD)患者血浆x-LDL程度较对照组明显为高，该程度独立于其它危险因素之外4。x-LDL直接损伤内皮细胞

8、，破坏其完好性，增加细胞死亡率。川芎嗪作为一种抗氧化作用机理抗动脉粥样硬化越来越受到重视5。LDH和DA是一种细胞内的酶，广泛存在于细胞浆内，当细胞破坏或细胞膜通透性增加时，其程度均明显增高，可反映细胞或细胞膜损伤的程度6。x-LDL作用于内皮细胞24h后促进细胞膜脂质过氧化和胞膜损伤，x-LDL组LDH、DA含量明显升高，而川芎嗪可使x-LDL损伤细胞的LDH、DA含量明显降低，说明川芎嗪通过去除氧自由基，到达修复和保护作用细胞膜的完好性的作用。高脂蛋白环境可使机体产生大量自由基，生物膜上的不饱和脂肪酸受活性氧作用，产生大量脂质过氧化物，使生物膜构造和功能改变，从而造成组织细胞的损伤。在保护

9、细胞免受或减轻活性氧损伤的过程中，细胞内SD和GSH-Px等具有抗氧化功能的酶起着不可无视的作用7。SD催化超氧根阴离子生成H22和2，GSH-Px可将H22和过氧化物复原为H2或相应无毒的醇。本结果证实,x-LDL组细胞内SD和GSH活性较空白对照组降低，川芎嗪保护组细胞内SD和GSH-Px活性比x-LDL组显著进步，可见川芎嗪具有保护细胞内SD和GSH-Px活性的作用，从而增强EV304细胞自身抗氧化才能。综上所述，川芎嗪可能是通过保护EV304细胞内SD和GSH-Px活性从而保护内皮细胞免于x-LDL造成的损伤。川芎嗪作为抗氧化的中药在动脉粥样硬化的临床治疗上有着广阔的前景。【参考文献】

10、1康奕飞，何兆初，吴竣，等.PPAR-冲动剂对大鼠内皮功能不全的作用及机制讨论J.医学理论与理论，2022，21(6):621.2anghunben,ZngYiqiang,uangsheng,etal.RapidislatinflargeauntfplasaVLDLandLDLbyatstepultraentrifugatinJ.AtaUnivedTngji,1995，24(3):169.3FuhranB,PartushA,Avira.Aetylhlinees2teraseprtetsLDLagainstxidatinJ.BiheBiphysResun,2022，322(3):974.4秦英，杨君，朱陵群，等.氧化低密度脂蛋白对人血管内皮细胞EV2304促增殖及诱导凋亡的作用J.中国病理生理杂志,2022，19(3):334.5霍伟琪.中药