发酵批报分析专家(FRAE)使用介绍

1、FRAE 使用手册 来自发酵人第 表 1），填写数据，前两行不能写数据，否则会产生异常。每增加一批数据，请插入一个“sheet”，不要有空的sheet.5.5 用户的报表不要设置密码保护，否则可能会出现异常。表 SEQ 表 * ARABIC 1批记录格式（以发酵批报为例）发酵工艺批报时间pH总糖还 原 糖氨基氮效价生物效价粘度PMV组分B联系方式：A、E.mail HYPERLINK mailto: B、或登录 HYPERLINK 给 网站管理员“细履平沙”留言C、或向发行商索要服务电话。软件应用附一份华东理工大学硕士论文第三章。这一章中是这一软件的典型应用。应用新型分析方法挖掘红霉素发酵批报

2、有效信息前言 目前，科研人员在发酵过程优化方面的研究涉及两方面的工作：实验和模型。实验数据是模型的基础，而模型可以使实验安排得更加合理和可靠，更易于实现过程的最优化，因此如何建立模型成为了研究人员关注的焦点 ADDIN EN.CITE Lee20067717Lee, K. M.Gilmore, D. F.Arkansas State University, Environmental Sciences Program, State University, AR 72467. klee0922yahoo.co.krStatistical experimental design for biopr

3、ocess modeling and optimization analysis: repeated-measures method for dynamic biotechnology processAppl Biochem BiotechnolApplied biochemistry and biotechnologyAppl Biochem BiotechnolApplied biochemistry and biotechnologyAppl Biochem BiotechnolApplied biochemistry and biotechnology101-161352Analysi

4、s of VarianceBioreactorsBiotechnology/*methodsFermentationLipids/biosynthesisModels, BiologicalMultivariate AnalysisResearch Design2006Nov0273-2289 (Print)17159235/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17159235 engPoirazi20078817Poirazi, P.Leroy, F.Georgalaki, M. D.Aktypis

5、, A.De Vuyst, L.Tsakalidou, E.Laboratory of Dairy Research, Department of Food Science and Technology, Agricultural University of Athens, Iera Odos 75, 118 55 Athens, Greece.Use of artificial neural networks and a gamma-concept-based approach to model growth of and bacteriocin production by Streptoc

6、occus macedonicus ACA-DC 198 under simulated conditions of Kasseri cheese productionAppl Environ MicrobiolApplied and environmental microbiologyAppl Environ MicrobiolAppl Environ MicrobiolApplied and environmental microbiology768-76733AnimalsBacteriocins/*biosynthesisCheese/*microbiologyFermentation

7、Hydrogen-Ion ConcentrationMilk/metabolism/microbiology*Models, Biological*Neural Networks (Computer)Sodium Chloride/pharmacologyStreptococcus/*growth & development/*metabolismTemperature2007Feb0099-2240 (Print)17158625/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17158625 engZeli

8、c2004323217Zelic, B.Vasic-Racki, D.Wandrey, C.Takors, R.Faculty of Chemical Engineering and Technology, University of Zagreb, Marulicev trg 19, 10000 Zagreb, Croatia. bzelicmarie.fkit.hrModeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed-batch bioreactorBioprocess Biosyst EngBioproces

9、s and biosystems engineeringBioprocess Biosyst EngBioprocess and biosystems engineeringBioprocess Biosyst EngBioprocess and biosystems engineering249-58264Bioreactors/*microbiologyCell Culture Techniques/*methodsCell ProliferationComputer SimulationEscherichia coli/*physiologyGlucose/*metabolism*Mod

10、els, BiologicalPyruvic Acid/*metabolism2004Jul1615-7591 (Print)15085423/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=15085423 eng于乃功200710310317于乃功阮晓钢基于细胞自动机模型的青霉素发酵过程优化控制策略北京工业大学学报北京工业大学学报150-154,1653322007张大鹏200610410417张大鹏 王福利何大阔何建勇桑海峰常玉清基于分时段参数修正的发酵模型的建立Chinese Journal of Sci

11、entific InstrumentChinese Journal of Scientific Instrument2712200626-30。目前，生物技术领域最有代表性的模型用在了同位素标记的代谢流计算上，因为该模型计算量大而复杂，涉及了上千个方程 ADDIN EN.CITE McKinlay2007454517James B. McKinlayYair Shachar-HillbJ. Gregory ZeikusClaire VieillecDetermining Actinobacillus succinogenes metabolic pathways and fluxes by N

12、MR and GC-MS analyses of 13C-labeled metabolic product isotopomersMetabolic EngineeringMetabolic Engineering177192 920071563572016duct isotopomers .pdfNoh2006474717Katharina NohAljoscha WahlWolfgang WiechertComputational tools for isotopically instationary 13C labeling experiments under metabolic st

13、eady state conditionsMetabolic Engineering Metabolic Engineering554-577820061337957440nary 13C labeling.pdf31,32，这些模型为我们深入了解细胞代谢提供了强大而可靠的工具。但是，这些研究多集中于对过程进行模型化，而对大量的发酵批记录的数据挖掘上研究甚少。目前我国各大型发酵企业每天都有多批发酵过程完成，每批都有大量的过程数据，且在现有企业中大量的有关生物技术特性参数（如糖、氮、磷、菌体量等）是通过离线测定来完成的，因此历史数据量极为庞大。这些蕴藏着丰富信息的数据得不到利用或利用不充分，势必

14、造成很大的浪费，如果能够从这些数据中得到有价值的规律，将会对发酵生产的稳定和提高起到积极的推动作用。本文以本实验室王军峰老师开发的一种基于数理统计的发酵批报集处理新方法来处理以往近100份红霉素发酵批报，对数据进行了处理分析与挖掘，希望得到一些对红霉素发酵优化研究具有参考价值的信息。3.2 方法和步骤3.2.1 主要步骤根据软件要求将批报中所有参数整理成一个excel文件，文件中每个sheet的列数据代表：相应参数按取样先后排序的数值，这里称为“列向量”，然后用软件处理这个文件得到有关参数与发酵结果的相关性，同时提取出能显著提高发酵结果的参数值范围，这些范围，在较大的置信概率下，构成了提高生产

15、效率的工艺调控策略。研究表明该方法可为科研提供有价值的线索，能够在计算机的辅助下快速完成对大量历史批报的数据挖掘工作。数据处理方法略3.3 应用批报处理软件对发酵过程参数的处理和分析首先将80份工业生产的红霉素的批记录(60t发酵罐)，按照相同的格式，集中到一个excel文件中，每张表(sheet)代表一个发酵批次的数据。表中第一列代表从小到大排序的时间列向量，之后是按照时间排序的pH、总糖、氨基氮、粘度、效价、补糖、补油、补醇列向量(见表1之表头所示)。然后用FRAE软件对数据进行处理。发酵过程各时刻参数对效价影响图3.1 发酵过程各时刻参数对效价影响的经验值i,j概貌Fig 3.1 Gen

16、eral picture of the experience value i,j of the various times parameters on the impact of titer in fermentation process图3.1中颜色越深表示相关性越强，深色方块多集中在第7个取样点之前，说明各个因素对发酵单位的影响发生在前期。表3.1 发酵过程各时刻的参数对发酵单位影响的经验值i,jTab 3.1 The experience value i,j of the various times parameters on the impact of titer in ferment

17、ation process进行红霉素工艺优化的主要目的是提高效价。本文计算了所有发酵过程参数对效价的影响值。表3.1表明48小时之前pH、64小时之前的总糖、848小时氨基氮、840小时粘度、48小时的起始效价、40小时之前的补油以及2448小时的补醇等这些时间段相关参数的变化对最终效价有显著影响。从时间上看，对效价有显著影响的点集中在前期，因此可以初步推定：影响红霉素最终效价的关键因素作用在前期，而pH、总糖、氨基氮、粘度、起始效价是这些关键因素的表现形式。 表3.1第7行第5列代表起始效价对最终效价影响的经验值是144。图3.2说明起步效价对发酵结果的影响很明显，起步效价高，则最终效价高，

18、得出这一结论的置信概率为95%(软件界面中有提示)，这也是对“影响红霉素最终效价的因素作用发生在前期”这一结论的一个有力支持。图3.2 起始效价高低对应发酵过程各时刻效价的均值及两组效价差异的置信概率Fig 3.2 The various times average titer of fermentation process corresponding start titer发酵过程参数优化该程序可以统计出各个参数对发酵单位影响的经验值，同时也能自动的根据高单位批次与低单位批次之间的差异，计算出所有参数的理想控制范围，这样就形成了发酵过程参数的控制策略，从而指导发酵过程的工艺控制。pH的控制从

19、图3.3可以看到高单位批次与低单位批次在pH控制范围上的差异：高单位罐批次前期pH上升高且早、后期也比低单位罐批的pH控制要高。工艺要求在发酵中后期将pH控制到6.67.2范围内，从图3.3可以看出在48小时之后，将pH控制到6.97.1之间更适合红霉素的生物合成，这与前人的研究结果一致，也证实了FRAE的统计结果的合理性。pH是菌体与培养基综合作用的结果，pH变化迅速说明菌体代谢旺盛，从图3.6可以发现这一阶段高单位批次的粘度高于低单位批次。说明在前期菌体生长快，将有利于后期的抗生素的合成。图3.3 高单位批次罐(深色)和低单位批次罐(浅色)的pH差异 Fig 3.3 The pH diff

20、erence of high titer batch(dark) and low titer batch(light)总糖的控制从图3.4总糖范围曲线变化可看到：高单位批次起步总糖值高于低单位批次。整个过程，高单位批次的糖代谢速率明显要快于低单位批次的罐批。调节发酵过程中糖代谢速率很难实现，但是初始的总糖浓度是可控制的。根据以上情况，我们推测在红霉素初始发酵培养基中增加糖浓度可能会提高发酵单位。在第5章中验证了这个推测。图3.4 高单位批次罐(深色)和低单位批次罐(浅色)的总糖差异 Fig 3.4 The total sugar difference of high titer batch(d

21、ark) and low titer batch(light)氨基氮的控制通过氨基氮范围曲线变化可看出与总糖曲线变化很相似：也表现出了初始氮基氮高，则代谢好的趋势。这就给了我们一个提示，在现有的设备条件下，前期氮源丰富可能更利于提高发酵单位，而要达到这一目的，一方面可以通过尽量减少消毒过程的损耗，另一方面可以增大营养物质配比，也可以减少接种量（本实验室已经将50L罐接种量从10%降到4%，发酵单位比之前有小幅提高）。通过图3.4和图3.5 可以推测出在被统计的发酵批报情况下发酵配方的C和N源有些偏少，有进一步优化的需求。图3.5 高单位批次罐(深色)和低单位批次罐(浅色)的氨基氮差异 Fig

22、3.5 The amino nitrogen difference of high titer batch(dark) and low titer batch(light) 粘度的控制图3.6 高单位批次罐(深色)和低单位批次罐(浅色)的粘度差异 Fig 3.6 The viscosity difference of high titer batch(dark) and low titer batch(light)从图3.6可以清楚的看到了，在前期和后期粘度大的批次发酵单位高。在生物发酵过程中，发酵液流变学特性对微生物发酵的影响至关重要。通过控制发酵液的黏度可以使细胞的浓度达到最大。不同微生物

23、细胞浓度对发酵液粘度的影响是不同的，这主要取决于微生物的细胞形态，含有菌丝体液体培养基的粘度要显著高于含有球形酵母或细菌细胞培养基的粘度。在较低的浓度下，发酵液的粘度与微生物细胞的浓度近似地呈比例关系，但若细胞浓度较高，则粘度迅速增大。同时红霉素又是一个发酵过程耗氧较大的产品，因此在大型生物反应器的设计，往往从工程角度考虑来满足其需求，目前最常用的方法即为：配备较高功率的电机（2 kw/m3以上）、配备具有全釜混合功能的轴向流搅拌、通入足够量的空气等；另一方面，单从工程角度考虑投入大，生产操作成本提高，同时也可能会产生气泛、气溶胶现象等严重影响供氧的副作用；且在真正的生产过程中若不能满足细胞代

24、谢特性的需求，则会导致产品生产的失败。因此红霉素发酵过程既要维持较高的菌浓，又要保证供氧的需要，就需要维持发酵液粘度在一个合理的范围内(见图3.6)。 补糖的控制图3.7 高单位批次罐(深色)和低单位批次罐(浅色)的补糖差异 Fig 3.7 The addition difference of sugar of high titer batch(dark) and low titer batch(light)根据图3.7，整体上看高单位罐批与低单位罐批在补糖策略上没有明显差异，从图3.4可以明显看出低单位批次在后期总糖明显高于高单位批次，说明低单位批次如果按照高批次相同的补糖策略，由于代谢相对

25、慢，导致糖积累。这种积累可能出现抑制次级代谢产物的可能，所以在生产控制中要根据残糖、粘度、pH等参数综合制订糖的补加策略，而不能一成不变。补油的控制图3.8 高单位批次罐(深色)和低单位批次罐(浅色)的补油差异 Fig 3.8 The addition difference of oil of high titer batch(dark) and low titer batch(light)从图3.8中可以看出，高单位批次与低单位批次在补油量的差异比较明显：高单位罐批表现了低补油速率。导致这种现象的原因可能是由于在现有设备中，供氧能力有限，如果补油量大，则氧的供应不足。所以对所分析的批报而言，

26、相对少的补油量对发酵过程更为有利。 讨论1.虽然从图3.43.9给出了各个参数的合理控制范围，但是发酵过程是复杂的多尺度系统，保持其它参数不变，而调节个别参数是不现实的，而且即便能够实现，也很难得到理想的效果，只能将这些参数综合在一起才是解决问题的根本。例如图3.8中，如果只是减少补油，而没有采取其它提高溶氧的措施，以后新罐批的统计结果未必还是这样。2.在对某一个图形进行分析的时候，不能脱离参数相关的思想，只有这样才能对图形体现的意义进行深入分析。在制定工艺策略时，要区分可控参数和不可控参数。优化的对象是可控参数，如初始的pH，总糖，温度，压力等。3.当发酵过程中两个参数不能同时控制到给出的范围时，要优先将相关性强的参数控制到它的高单位通道内，相关性强弱需要通过表3.1进行判断，值越大，则相关性越强。4.软件