透明质酸寡糖逆转MCF7ADM耐药及促凋亡作用研究

1、透明质酸寡糖逆转MCF?7/ADM耐药及促凋亡作用研究王丽萍王宝中司海运赵春亭隋振霞【摘要】目的研究透明质酸寡糖逆转F?7/AD细胞耐药的作用。要领TT法研究透明质酸寡糖对F?7/AD耐药逆转作用，流式细胞术测定细胞外貌耐药相干卵白P?gp、RP的表达及凋亡调控卵白p53、bl?2的表达。结果透明质酸寡糖可进步F?7/AD对化疗药的敏感性，使P?gp、RP表达落落，p53表达增高。结论透明质酸寡糖可部门逆转F?7/AD耐药及促进凋亡的作用。【关键词】透明质酸寡糖F?7/AD逆转耐药凋亡肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性是肿瘤治疗失败的紧张缘故原由，落服多药耐药性的要领之一是利用逆转剂1，2。如今

2、虽已寻到很多逆转多药耐药的药物，但是，或由于结果不敷满足，或其毒副作用较大，很难在临床推广。本实行利用人乳腺癌耐阿霉素细胞系，以TT法、流式细胞术，研究透明质酸寡糖hyalurnateligers，lig?HA对耐药细胞的增敏及耐药逆转作用，并从低落膜外貌转运卵白表达，促进耐药细胞凋亡的角度探究其逆转耐药的机制，以期能探求到逆转DR作用强、毒性小的药物。1质料与要领1.1质料乳腺癌F?7/S敏感细胞及对阿霉素耐药F?7/AD细胞，源于中国医学科学院天津血液病研究所。细胞造就于ID造就液中，含10胎牛血清，试验用对数生恒久细胞。PE?P?gp单抗、PE?RP单抗、FIT?bl?2单抗、FIT?p

3、53单抗，均为美国BisienesPharingen产物；lig?HA.2500Da和TT别离为SEikagaku公司、Siga公司产物。EL340i型酶联免疫仪，美国Bitk公司；FASaliber型流式细胞仪，美国BD公司。1.2要领取对数生恒久的F?7AD细胞系，均随机分为实行孔和比较孔，各组实行孔和比较孔别离设6个复孔，每组实行重复3次。此中实行孔参加差异浓度50g/l、100g/l、150g/l的透明质酸寡糖以下均用HA1、HA2和HA3表现。比较组不加任何试剂或加等体积的造就液。各实行孔细胞均与lig?HA共造就48h后，网络并举行以下各试验。将上述经lig?HA作用后的实行组细胞

4、和比较组细胞网络后，以5104接种于96孔板中，每孔190l375%2、饱和湿度的条件下造就24h，然后参加差异浓度梯度的抗癌药物另设空缺比较孔及调零孔，每浓度设6个复孔。在造就箱里让细胞与药物作用48h。每孔参加101的TT，继承造就3h，弃上清，每孔参加DS100l，振荡使甲瞻晶体充实溶解后，用酶标仪(波长490n)检测D值；然后盘算各组的细胞存活率、殒命率及耐药逆转倍数。细胞存活率=实行组D比较组D100细胞殒命率=(1-实行组D比较组D)100耐药逆转倍数=逆转剂加抗癌药物组细胞殒命率抗癌药物组细胞殒命率别离向上述实行孔和比较孔细胞中参加终浓度为10gl的阿霉素。在原细胞造就条件下，继

5、承造就3h,经流式细胞仪检测细胞内AD的相对荧光强度。网络上述造就的各组实行孔和比较孔细胞并调治浓度为1106l，参加PE标识表记标帜的P?gp抗体20l，37避光胞膜染色30in，流式细胞仪检测均匀荧光强度。细胞造就及实行分组同上，别离参加FIT标识表记标帜的bl?2及p53抗体20l，流式细胞仪检测均匀荧光强度。接纳SPSSl00软件包举行统计学处置惩罚。数据用均数尺度差(xs)表现，计量资料用配对t查验，以P005作为明显边界。2结果2.1lig?HA加强耐药细胞对阿霉素的敏感性差异浓度lig?HA均能显着增长耐药细胞F?7/AD对AD的敏感性，增长耐药细胞殒命率，与比较组比力差异有明显

6、性(P005)，增敏倍数别离为1.48、2.04、1.89;别的，F?7/AD与F?7/S组间各细胞殒命率比力，差异亦均具统计学意义(P005)(见表1)。2.2lig?HA增长胞内AD积蓄流式细胞仪检测104个耐药细胞内AD的相对荧光强度，HA1+AD、HA2+AD、HA3+AD组荧光值别离为15.78119、19.34065和19.57161；雷同造就基的F?7/AD中直接加AD组比较组荧光值为1268054。结果表白，三组均能显着增长AD在细胞内含量，使AD胞内积聚增长121、1.44和143倍，与比较组比力有明显性意义(P005)；别的，HA2、HA3剂量组间未表现有显着的差异(P00

7、5)；HA1与另两组比力差异有统计学意义(P005)。2.3lig?HA对耐药相干卵白及凋亡调控卵白的作用见表2。与比较组细胞比力，各浓度lig?HA均能显着低落膜外貌P?gp、RP表达(P值均005)，此中，HA2与HA3组间未表现有显着的差异(P005)。别的，HA2、HA3浓度组均可上调凋亡调控卵白p53表达(P值均005)；且各组均对bl?2表达无显着作用(P005)，说明各浓度lig?HA均有必然程度低落膜外貌耐药卵白表达及促耐药细胞凋亡的作用。3讨论如今研究已证明，P?gp高表达是肿瘤细胞多药耐药的产生气制之一，P?gp是一种能量依靠性药物排挤泵，通过ATP供给能量，可将抗肿瘤药物

8、由细胞内泵出，使其细胞毒作用削弱或消散，而导致化疗失败。比来，研究职员创造先前被以为在细胞中起到布局性和惰性作用的透明质酸，终究上是引发癌细胞抗药反响的关键物质，透明质酸能和其受体卵白D44结合，与磷酸肌醇?3激酶一起，促使癌细胞增长天生，能把药物运输出细胞的卵白质如P?gp，从而使癌细胞产生抗药性3，4。癌细胞中透明质酸的量越多，抗药性就越强。因此假设可以或许阻断这一环节，大概增敏化疗药物抗性的癌细胞对化疗药物的敏感性。多糖低聚物或单抗能与透明质酸的一个受体D44结归并制止它启动一种大概导致药物抗性的信号级联，从而逆转耐药。尚有文献报道，肿瘤细胞多药耐药的产生气制涉及肿瘤按捺卵白p53的失活

9、，诱导耐药细胞的凋亡大概对改进耐药细胞的对药性有必然作用5，6。bl?2和p53均为凋亡调控卵白，bl?2按捺肿瘤细胞凋亡，p53促进肿瘤细胞凋亡。因此，p53表达上调或bl?2下调，均能促进肿瘤细胞凋亡而到达必然程度逆转耐药的作用。本实行从阻断信号传导和促进凋亡两方面来研究lig?HA对耐药细胞系逆转耐药的作用，为临床应用提供理论基矗我们的研究表白透明质酸寡糖的干预能加强化疗药AD对F?7/AD的敏感性，使AD对耐药细胞的杀伤性增大，并可增长胞内化疗药物浓度，以逆转F?7/AD细胞的耐药性。同时创造随着透明质酸寡糖浓度(50g/l150g/l)的增大，耐药肿瘤细胞殒命率渐渐增高，且胞内阿霉素

10、的浓度亦增多，逆转本领渐渐加强。别的，我们创造颠末处置惩罚后的耐药细胞，耐药卵白P?gp、RP的表达率显着低落；透明质酸寡糖浓度在50g/l时p53的表达无显着上调，但随浓度的进步，p53表达显着上调。从而提示透明质酸寡糖大概通过按捺DR卵白的表达、调控凋亡卵白来逆转细胞对AD的耐药，且上调凋亡卵白的透明质酸寡糖浓度应大于50g/l。综上所述，临床应用透明质酸拮抗剂如小分子的透明质酸寡糖可以或许逆转癌细胞药物抗性。我们可以假想将这种透明质酸拮抗剂与化疗相结合，大概会到达更好的治疗结果。【参考文献】1GttesanHanerellsevadehetherapy:SixteenthRihardan

11、dHindaRisenthalfundatinaardletureJ.anerRes,1993，53(4)：747-7512StellerHehanistnsandgenesfellularsuiideJSiene,1995,2675203：1445-14493israS,GhatakS,Zltan?JnesA,etal.RegulatinfultidrugresistaneinanerellsbyhyalurnanJ.JBilhe,2022,278(28):25285-25288.4Sunitiisra，ShibnathGhatak,BryanPTle.RegulatinfDR1expressinanddrugresistanebyapsitivefeedbaklpInvlvinghyalurnan,phsphinsitide3?Kinase,andErbB2J.JBilhe,2022,280(21):20310-20315.5刘