连接蛋白43磷酸化状态与缝隙连接通道功能的关系

1、连接蛋白43磷酸化状态与缝隙连接通道功能的关系【摘要】缝隙连接(GJ是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜构造。连接蛋白43(x43的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响。激活不同的蛋白激酶可引起x43的羧基端21个丝氨酸中的12个残基、6个酪氨基的2个残基(247、265磷酸化；通过点突变方法研究发现,这些特殊部位的磷酸化导致GJ通道功能改变。现就x43磷酸化状态与GJ通道功能的关系作一综述。【关键词】缝隙连接；连接蛋白43；磷酸化；去磷酸化研究说明，连接蛋白43(x43和细胞间隙连接通讯(GJI在多种心血管疾病的发生、开展起重要作用。高血糖可以促进x43磷酸化，引起缝隙连接(GJ功能

2、的改变。因此，研究x43的磷酸化状态改变与心脏GJ功能的关系，对说明磷酸化对GJ的作用机制，说明D患者心律失常的发活力制有重要意义。1GJ的构造GJ又称间隙连接、通讯连接,是由连接相邻2个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜构造。每个GJ通道由相邻2个细胞各提供1个一样或不同的连接子(亦称为半通道以非共价键对接而成的亲水通道，直径约1.5n,允许分子质量低于1ku的离子或小分子物质通过,这是GJ执行各种生理功能的构造基矗连接子是由6个一样或不同的亚单位即x环绕排列成的中空小管,其外形如棒状,直径67n。2GJ的功能相邻细胞间通过GJ所介导的GJI进展着信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交

3、换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。其生理功能主要有心脏和神经元组织中动作电位的快速传导，其中x43单通道电导为60100ps1;细胞间代谢产物或营养物质和水分子的被动扩散，如核苷酸、ATP、葡萄糖等2；细胞间各种离子或第二信使如a2+、三磷酸肌醇及环化核苷酸的交流3。3GJ功能的调节GJ通道的功能包括介导细胞间电耦联和化学耦联。评价GJ功能的方法主要有膜片钳技术和低分子染料通透试验。x43形成的GJ通道允许分子质量小于1000u和/或直径小于1.5n的离子或小分子通过。由于GJ通道具有口径大、低选择性、开放稳定性及协作的双细

4、胞构造等特点，因此GJ通道一般不被认为是通常意义上的离子通道，而被认为是具有自己独特构造、功能和特性的一种特殊通道。GJ通道的功能受多种因素的影响，这些因素主要有胞内pH值、a2+浓度、x的磷酸化状态、跨通道电压以及一些神经体液因子。胞内pH值降低可致GJ通道功能减弱甚至关闭，细胞间失去耦联。胞内a2+浓度下降时，GJ通道的电导呈剂量依赖性下降，而当胞内a2+浓度与pH值同时下降时，那么电导下降更为明显46。4x434.1x43的构造编码人类x43的基因位于6q22.3，全长约3.0kb。x基因家族是保守的，不同的x具有共同的构造特征。x43属于x亚组，分子质量43ku，其蛋白质肽链由382个

5、氨基酸构成，其中氨基酸1242构成管道局部，243382为细胞质尾部7。从氨基末端(N端至羧基末端(端共出入细胞膜4次，形成2个胞外环和1个胞内环，4个螺旋构造的跨膜片段，从N端至端分别是14，N端和端均位于细胞质内。x最为保守的区域是2个胞外环，其次是4个跨膜片段，N端保守性次于跨膜片段，亦为保守区域。胞内膨大的端氨基酸数目和序列区别较大，是不同x的主要区别。x43的细胞质尾部在不同种属和不同组织间长度稍有变化8。另外，x的大多数功能调节位点也在端9。4.2x43的生命周期x43在SDS_PAGE上至少表现为P02等3条分子质量从4046ku的区带。有时在P0和P1_x之间有1个次要的磷酸化

6、条带P；在有丝分裂细胞等还可以见到超磷酸化的x43条带P3。P0代表刚合成非磷酸化的x43，分子质量约4042ku；P1代表局部磷酸化的x43，分子质量约4344ku；P2代表高度磷酸化的x43，分子质量约46ku10_11。利用x43在电泳凝胶上挪动性的改变，是判断其磷酸化较为简单和常用的方法。通常情况下，x43首先在内质网合成，然后转运至高尔基复合体，最后在细胞膜上聚集形成GJ12，但在转运至细胞膜之前，是否有先形成寡聚体那么仍不清楚。在应激条件下，GJ单位通过胞吞，被从斑块的中央加速移除，形成环状GJ，与胞吞小体结合，进而被溶酶体降解。x处于动态变化过程，x43的半衰期约13h13。较短

7、的半衰期对快速调节通道数量具有重要意义。5GJ通道功能调节与X43磷酸化状态的关系蛋白质磷酸化作用是真核细胞信号转导中的核心,通常磷酸化作为一个分子开关在不同通路如代谢、信号转导和细胞分裂等控制着蛋白质的活性,蛋白质的磷酸化参与酶的作用机制,以及介导蛋白质的活性。X43的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响14,X43的端241382为主要磷酸化区,也是多种激素的识别位点,丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基的磷酸化程度决定着GJ通道的通透性及功能,在心肌细胞,X43的磷酸化使GJ通道开放,去磷酸化使该通道关闭,而且是该通道解聚的关键点,X43一旦去磷酸化,该通道即开场解聚为x亚单位,而x亚

8、单位可以进一步解聚或转入细胞内储存，对大多数细胞如平滑肌细胞、肝上皮细胞x磷酸化那么导致GJI的中断x翻译后经磷酸化而发生构造及功能的改变,磷酸化在x的生命周期(如运输、合成、分解、降解以及GJ通道的门控方面起着重要的调控作用。5.1蛋白酪氨酸激酶(PTK5.1.1非受体PTK_Sr蛋白激酶是正常细胞的酪氨酸特异性蛋白激酶，而其基因细微改变后表达的v_Sr蛋白激酶那么是一种致瘤性蛋白激酶。Sr通过多种机制影响x43通道功能：作用于蛋白激酶(PK、丝裂原活化蛋白激酶(APK等丝氨酸激酶，进而磷酸化x43，抑制通道功能；影响能作用于通道功能的蛋白质的表达；直接磷酸化x4315。v_Sr直接磷酸化x

9、43的Tyr247和Tyr265位点，引起通道关闭，可能与降低通道开放概率有关，而非通过降低单通道传导性16。Tyr265位点突变，v_Sr那么无法磷酸化x43，但单纯的Tyr265位点磷酸化并缺乏以使通道关闭，只有进一步磷酸化Tyr247才使得通道关闭，可能的作用方式：v_Sr通过SH3构造域与x43富含脯氨酸的274283区域结合；接着磷酸化x43，主要在Tyr265；v_Sr的SH2与x43Tyr265对接，增加亲和力并使Sr磷酸化Tyr247导致通道关闭17。5.1.2受体PTK表皮生长因子(EGF可引起x43的磷酸化，主要作用在Ser残基。EGF激活相应受体的酪氨酸蛋白激酶活性，通过

10、APKs引起x43S255、S279、S282磷酸化，降低通道开放概率，使通道关闭18。血小板衍化生长因子引起的x43通道功能中断那么不只与x43的磷酸化或APKs的活化有关，还可能需要另外的信号途径，但详细磷酸化Ser的哪个位点仍不清楚。5.2丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶5.2.1APKs包括ERK1/2、BK_1(ERK5、p38、JNK等。APK可磷酸化x43的Ser279和Ser282等位点，引起的GJI快速短暂性降低19_20。5.2.2PK在体外，PK可磷酸化x43的Ser372和Ser368位点。PK的冲动剂，如12_十四烷酰佛波醋酸酯_13、佛波醇乙酯可增强S262和S368的磷酸化

11、程度，前者的磷酸化使得细胞增生增强，但详细机制未明，后者通过降低单一通道传导性来降低GJ功能21,10。高糖可以通过PK高磷酸化x43的Ser368位点从而抑制平滑肌细胞的GJI22。另有报道，高糖通过PK高磷酸化x43，刺激x43的降解，从而抑制肾小管内皮细胞的GJI23。EK_VITRIN等24研究发现，PK高磷酸化x43的Ser368位点，降低通道的选择通透性，降低GJ功能。5.2.3蛋白激酶A(PKASer364位点的磷酸化对AP上调x43的组装很关键，该过程由PKA介导，但PKA是否直接磷酸化x43的这个位点，还是通过活化其它酶再引起该位点的磷酸化仍不非常清楚25。磷酸化的Ser36

12、4可能对AP引起的GJ装配增加起关键作用，而对根底状态下的GJ装配的作用较为次要26。YG等27发现卵泡刺激素可引起大鼠颗粒细胞x43的Ser365、Ser368、Ser369、Ser373等位点的超磷酸化，并证明这些位点的磷酸化由PKA介导，这4个位点的超磷酸化增强了通道的形成及功能。5.2.4蛋白激酶G(PKG在大鼠心肌细胞中，环磷酸鸟苷可激活PKG，能通过磷酸化x43的Ser257，降低单通道传导性,使细胞间传导性和对染料的通透性降低28。5.2.5酪蛋白激酶1(K1体外K1，特别是其delta亚型，可直接磷酸化x43的Ser325、Ser328或Ser330等位点，调节细胞膜上的x43

13、装配形成GJ通道，抑制K1减少x43的磷酸化，伴随x43朝向细胞膜的减少29。LAPE等30研究提示，Ser325/328/330的磷酸化可影响通道的选择通透性及装配，将Ser325/328/330位点突变为丙氨酸后，通道功能明显下降，表现为染料罗氏黄转移才能降低，该过程由K1介导，心肌缺血通过降低x43的磷酸化程度，降低通道功能。5.2.6细胞分裂周期蛋白激酶2是一种蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶,对有丝分裂的正确起始有重要作用。其在x43的作用靶点可能是Ser255，可磷酸化x43的Ser255，或通过激活其他激酶使x43磷酸化，使GJ通道转移至细胞内，引起GJI短暂的降低31。【参考文献】1F

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