消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物

1、消痰通腑方对结肠癌SW480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物消痰通腑方对结肠癌S480细胞磷脂酶A2、环氧合酶2表达及细胞生物学行为的影响结肠癌是常见的恶性肿瘤，其发病率在男性和女性中分别位居第3位和第2位，且有逐年上升趋势1。结肠癌属中医学肠蕈范畴，多因饮食失节、脾胃受损、湿热壅聚成痰而搏结肠腑所致。消痰通腑方为魏品康教授从痰论治消化道肿瘤核心治那么消痰散结八法之一。磷脂酶A2phsphlipaseA2，PLA2是一类可催化脂肪酸水解并产生以花生四烯酸arahidniaid，AA为主的游离脂肪酸酶，具有产生炎性介质、参与细胞信号转导等多种功能，在人类肿瘤发生、开展中发挥重要生物效应2

2、。环氧化酶ylxygenase，X是PLA2催化AA生成生物活性分子的限速酶，包括X-1和X-2。研究说明，X-2在结肠中过度表达，其与细胞增殖、分化等有关3。本研究采用消痰通腑方干预结肠癌S480细胞，观察其对细胞增殖、迁移的影响，讨论其分子作用机制。1实验材料1.1细胞株人结肠癌S480细胞，中国科学院上海细胞库。1.2药物及制备消痰通腑方由制半夏、制南星、大黄、陈皮、鸡内金、炙甘草组成，所有饮片由上海雷允上药业提供。消痰通腑方由第二军医大学试剂中心制备，按比例制半夏15g，制南星15g，大黄6g，陈皮15g，鸡内金15g，炙甘草6g称取10倍量的饮片，加8倍体积的75%乙醇，回流提取煎煮

3、2次，每次1h，将煎液合并后离心、浓缩、枯燥至干品即得消痰通腑方醇提物，其得率为1g原药材/0.26g。等比例换算至药物浓度分别为2.24、8.96g/L。实验前称取适量醇提物干粉，经涡旋、超声、水浴等方法使其充分溶解于DE培养基后，0.22滤器过滤并配置成所需浓度的溶液，4冰箱贮存备用。1.3主要试剂与仪器DE培养基，胎牛血清FBS，0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液，qPR、DNA反转录、总RNA提取试剂盒，transell小室，K8溶液，PLA2抗体，X-2抗体，PLA2shRNA质粒，shRNA对照质粒，shRNA质粒转染试剂，均购自Santaruz公司。超净工作台广州深华生物技术，2

4、培养箱、BIATE型紫外可见分光光度计Ther，LXJ-A型离心机上海安亭科学仪器厂，GE4852型PR仪杭州柏恒科技，DYZ-24DN电泳仪北京六一仪器厂，Tan500全自动凝胶成像系统南京裴尔森生物科技。2实验方法2.1细胞培养及药物干预结肠癌S480细胞常规培养于含10%FBS和1%青-链霉素双抗DE培养基，每隔12d换液，待细胞交融约80%时进展细胞传代及种板。消痰通腑方原药材浓度为8.96g/L，经0.22无菌过滤器过滤，用培养基稀释成实验所需浓度。实验根据药物浓度分为对照组0g/L、低剂量组2.24g/L、高剂量组8.96g/L。2.2K-8法检测取对数生长期上述3组细胞，经胰酶消

5、化后，接种于96孔板，每孔细胞数为1103。每组设5个复孔。分别于24、48、72、96、120h后加10LK-8溶液。置于培养箱培养4h，于酶标仪波长450n处测定细胞吸光度A值，计算细胞相对增殖率实验组A值-对照组A值对照组A值100%。2.3平板克隆形成实验取对数生长S480细胞悬液梯度倍比稀释后，接种于6孔板中，每孔50个细胞。置于培养箱内培养24h，各组分别参加各浓度消痰通腑方本文由论文联盟.Ll.搜集整理溶液，重新置于培养箱中，经常观察，当出现肉眼可见克隆时，弃去上清液，PBS清洗2次，甲醇溶液固定15in后加Giesa染液染色。计算克隆细胞数目。实验重复3次，取其平均值。2.4T

6、ransell小室实验搜集3组细胞，800r/in离心5in，PBS清洗2次，用培养基重悬并调整细胞浓度为1109/L。分别取100L细胞液置于Transell小室上层，同时在下层加500LDE培养基。37培养箱中培养48h，擦净小室滤膜上层的细胞。4%多聚甲醛固定10in，PBS清洗并用结晶紫染色。每组同时做3个重复小室，200倍显微镜下计数并拍照。2.5RT-qPR检测结肠癌S480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2RNA表达从GeneBank网站获取PLA2、X-2基因序列，并使用Preier5.0软件设计引物见表1，引物由上海生工生物工程合成。采用Trizl试剂提取细胞总RNA，每份样品均取2

7、g，按试剂盒说明进展反转录。以Tubulin为内参，PLA2、X-2表达的相对定量值用于统计分析。2.6esternblt检测结肠癌S480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2蛋白表达用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解并搜集细胞总蛋白，BA法检测蛋白浓度后参加上样缓冲液，煮沸变性。样品进展SDS电泳，电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭2h后，特异性一抗4摇床过夜，洗膜后，二抗孵2h，E显影。2.7shRNA转染实验人结肠癌S480细胞分为PLA2shRNA干扰组、质粒对照组、对照组，每组设3个复孔。以2gPLA2shRNA质粒和对照质粒分别转染S480细胞，转染24h后，用5g/L嘌呤霉素挑选细胞株，

8、继续培养24h。对照组为不加任何处理的S480细胞。3统计学方法采用SPSS16.0统计软件进展分析。计量资料以xs表示，采用t检验。P0.05表示差异有统计学意义。4结果4.1消痰通腑方对结肠癌S480细胞增殖的影响高剂量组较对照组增殖才能明显减弱P0.05，低剂量组也能抑制细胞增殖但效果不如高剂量组，结果见图1。高剂量组克隆形成率为48.383.67%、低剂量组为121.132.64%，较对照组205.653.72%明显降低P0.05，P0.01，结果见图2。4.2消痰通腑方对结肠癌S480细胞侵袭才能的影响消痰通腑方作用48h，低、高剂量组较对照组穿膜细胞数明显降低P0.05，P0.01

9、。结果见图3。4.3消痰通腑方对结肠癌S480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2RNA和蛋白表达的影响消痰通腑方作用72h，PLA2、X-2RNA和蛋白表达量均显著降低，与对照组比拟差异有统计学意义P0.05；高剂量组较低剂量组差异更显著P0.05。结果图4、图5。4.4PLA2shRNA干扰后消痰通腑方对结肠癌S480细胞磷脂酶A2和环氧合酶2蛋白表达的影响PLA2shRNA干扰48h，与质粒对照组和对照组相比拟，转染PLA2shRNA质粒的S480细胞PLA2蛋白表达明显受到抑制，PLA2shRNA干扰成功。同时，X-2的表达与PLA2的表达具有一致性。结果见图6。5讨论中医学认为，结肠癌多因饮食

10、失节，嗜食肥甘厚腻，困遏脾土，而致脾胃受损，脾运化失常，湿浊内生，气机阻滞，精微不能正常布散而发玻湿聚为痰，热炼津为痰，故湿热壅聚那么久能生痰，搏结肠腑，致肠腑湿热重滞，气机运化不畅，大肠传导失司，痰热湿浊不能及时排除体外而在体内停聚，日久形成积块而成痰结4。消痰通腑方为魏品康教授从痰论治消化道肿瘤的经历用方。研究说明，该方可抑制炎症因子引发的炎症反响5-6。方中制半夏、制南星为消痰散结之君药，大黄、炒枳实壳清热通腑为臣药，鸡内金、陈皮理气消积，顾护脾胃为佐使，炙甘草调和药性，共奏消痰散结祛除痰结、清热通腑推陈出新。PLA2是磷脂代谢的关键酶之一，可分解磷脂产生AA从而进一步产生X-2、前列腺素E2PGE2等炎性介质，从而引发炎症。研究说明，PLA2的活化与多种肿瘤相关7-9。慢性炎症促进肿瘤的发生开展涉及多条细胞内信号通路，其中PLA2-X-2-PGE2信号通路是其重要途径之一。研究说明，结直肠癌的开展常伴随着X-2基因过度表达，其过度表达可通过促进细胞的增殖、存活，进而在肿瘤进展中发挥重要作用10。本实验结果显示，与对照组比拟，高剂量组能降低结肠癌细胞增殖才能P0.05，抑制结肠癌细胞的迁移P0.01。低剂量组虽不如高剂量组效果好，但与对照组比差异有统计学意义P0.05。而且消痰通腑方能降低结肠癌S480细胞PLA2及X-2的表达，PLA2shRNA干扰实验进一