蛋白质组学知识讲座

1、1蛋白质组研究第1页2蛋白质是基因表示产物和基因功效执行者，基因组所包含功效信息必须在蛋白质水平上进行解释，才能最终得到明确结论。所以，要想说明生命过程本质，对蛋白质组研究就成了一个必定选择。蛋白质组研究必要性蛋白质基因多少动态静态翻译后修饰序列恒定组分复杂简单网络独立第2页3 基因组 转录组 蛋白质组第3页4基因组告诉你，理论上能够发生什么？mRNA告诉你，可能发生什么？蛋白质组告诉你，正在发生什么？第4页5蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表示全部蛋白质）1994年由澳大利亚科学家Wi

2、lkins提出，是一个动态概念，指是不一样细胞在不一样时相表示不一样蛋白质 蛋白质组（原核生物和真核生物）对应于基因组全部蛋白质组成整体，不是局限于一个 或几个蛋白质同一基因组在不一样细胞、不一样组织中表示情况各不相同 在空间和时间上动态改变着整体整体性、动态性和系统性3.1概述第5页6蛋白质组学(proteomics): 指应用各种技术伎俩来研究蛋白质组一门新兴科学，其目标是从整体角度分析细胞内动态改变蛋白质组成成份、表示水平与修饰状态，了解蛋白质之间相互作用与联络，揭示蛋白质功效与细胞生命活动规律。细胞器蛋白质组学：经过纯化细胞器或用质谱仪判定蛋白质复合物组成来确定蛋白质在亚细胞结构中位置

3、。表示蛋白组学：把细胞、组织中全部蛋白质建立成定量表示图谱或扫描EST图。蛋白质组学包含:3.1.3 蛋白质组学第6页7Western blot、免疫组化验证蛋白质并确定其定位依据氨基酸序列合成寡核苷酸探针，克隆基因蛋白质功效研究，包含蛋白质生物活性、抗体制备、蛋白质相互作用等方面蛋白质样品电泳前蛋白质样品处理双向电泳分离 Western blot检测选择目标蛋白斑点，胶内酶切质谱分析（MALDI/TOF或ESI/MS/MS）取得肽质量指纹谱或肽序列标签数据库检索判定蛋白质电转印到膜上 图像分析 样品处理蛋白质分离蛋白质判定 蛋白质组学研究流程图第7页8蛋白质组学研究内容1、蛋白质组表示模式（

4、组成）研究蛋白质组成份判定、数据库构建、新型蛋白质发觉、同源蛋白质比较、蛋白质加工和修饰分析。2、蛋白质组功效模式（作用）研究基因产物识别、基因功效判定、基因调控机制分析。主要生命活动分子机制（如细胞周期、分化与发育、环境反应与调整等）。医药靶分子寻找和分析（包含新药靶分子、肿瘤分子标识、人体病理介导分子等）。第8页93.2.3 蛋白质组研究技术一、双向凝胶电泳技术二、液相色谱技术三、生物质谱技术与蛋白质判定四、蛋白质相互作用研究技术第9页10 一、双向凝胶电泳技术（一）2-DE概念two dimensional gel electrophoresis 2-DE是指第一向固相pH梯度（immo

5、bilized pH gradient，IPG）等电聚焦电泳与第二向SDS组成分离系统，也称双向聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称2-DE。等电聚焦电泳是基于蛋白质等电点（pI）差异进行分离，SDS则是依据蛋白质分子量（Mw）不一样进行分离。 第10页11第一向等电聚焦酸碱IPG胶条pH梯度低分子量高分子量第二向SDS图7-2 双向凝胶电泳示意图第11页121、第一向电泳IPG等电聚焦电泳 1）等电聚焦电泳基本原理 等电聚焦（IEF）是60年代发展起来一个蛋白质分析分离伎俩，如图所表示，在电场中电泳基质形成一个从正极到负极不停增大pH梯度，因为蛋白质为两性电解质，带负电荷蛋白质分子向正极移动，带正电荷蛋

6、白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自pI处时，所带净电荷变为零，于是停顿迁移而留在该位置上。这种不一样蛋白质分别聚集在各自pI处，形成一条狭窄稳定区带而彼此分开现象称为等电点聚焦。第12页131098765432pHpI8.0蛋白质pI4.0蛋白质 等电聚焦“聚焦效应”第13页14+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10第一向：等电聚焦第14页15第15页162、第二向电泳SDS- PAGE1）SDS原理 在PAGE系统中加入SDS和还原剂后所组成电泳系统。SDS是一个阴离子去垢剂，疏水端能插入蛋白质

7、分子内，破坏蛋白质分子内氢键及疏水作用，改变蛋白质分子三级和四级结构；还原剂则断裂蛋白质分子内二硫键，使蛋白质分子去折叠，结构变得舒展。蛋白质分子与SDS充分结合后，形成带负电荷蛋白质-SDS复合物，所带负电荷大大超出蛋白质分子原有电荷量，消除了不一样分子间原有电荷差异。蛋白质-SDS复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中迁移率不再与电荷相关，而主要取决于椭圆棒长轴长度，即蛋白质分子量大小。 第16页17+pH 3pH 7.5pH10chargesize第二向：SDS电泳Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their

8、size.Smallest proteins travel the furthest distance第17页18双向电泳流程样品制备第一向等电聚焦第二向SDS凝胶上蛋白检测蛋白软件检测第18页19（二）凝胶上蛋白质检测蛋白质样品经2-DE分离后，凝胶上蛋白质斑点须用一定方法使其显现出来，让仪器或人眼检测到。第19页20染色方法考马斯亮蓝染色银染（不含戊二醛）荧光染色（Cy3, Cy5），放射性同位素标识等第20页21 （一）考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色是最惯用蛋白质染色方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋白质碱性基团可逆结合，染色线性范围可达

9、155g，灵敏度为30100ng蛋白质。考马斯亮蓝染色最大优点是染色重复性好，操作简便，不影响后续质谱判定，灵敏度比惯用氨基黑高100倍，但低于银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋白质检测要求，样品用量大。第21页22 （二）银染色 原理 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马斯亮蓝染色法100倍，但操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结合蛋白染色效果差。第22页23 (三) 荧光染料染色 荧光染料染色法是利用结合于蛋白质荧光染料发出荧光来检测蛋白质。用于蛋白质染色荧光染料很多，有

10、共价结合于蛋白质上，有和蛋白质形成非共价结合。当前商品化荧光染料有SYPRO Ruby, 其染色方法操作简便，灵敏度高达110ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影响后续质谱判定，是一个较理想蛋白质染色方法，但价格较昂贵。 第23页24（三）双向凝胶电泳图谱计算机分析细胞或组织样本经2-DE分离后，得到一张含有成百上千个蛋白质斑点凝胶电泳图谱。凝胶图谱分析包含确定蛋白质斑点位置、大小、染色深浅、pI和分子量；图谱间比较、差异蛋白质斑点确实定；图谱质量优化、数据储存管理、数据库分析等内容。借助先进计算机技术和生物信息学工具，能客观、有效地从电泳图谱中提取到有价值信息。 第24页2

11、5（四） 2-DE分辨率、重复性及不足2-DE系统有很高分辨率。商品化IPG胶条以及标准化试验操作使得2-DE含有很高重复性，可在不一样试验室间进行图谱比较，给蛋白质组数据共享带来了极大方便。当前没有一个分离技术在分辨率上能与双向凝胶电泳相媲美。 第25页262-DE存在不足和缺点：首先，2-DE分辨率仍不能满足蛋白质组学研究需要，人类基因组有2万3万个基因，可能表示蛋白质达数十万种，这对2-DE技术分离能力提出了严峻挑战；其次，2-DE对极酸、极碱性和疏水性膜蛋白分离效果不尽人意，对含有主要功效低丰度蛋白质检测也是个很大难题；最终，2-DE操作过程自动化是一个亟待处理难点，自动化操作平台可降

12、低人为误差，提升试验结果重复性，带来高通量分析速度，满足大规模蛋白质组学研究需要。第26页27（五）双向凝胶电泳分离前样品处理 1、分部提取法 用不一样蛋白质提取液分部抽提细胞或组织裂解液，先用水溶液抽提，离心后上清液中含大部分水溶性蛋白；再用对膜蛋白含有中等溶解度提取液抽提沉淀，离心后上清液中含中等疏水性蛋白质，包含膜表面蛋白和膜相关蛋白；最终用强溶解力提取液抽提沉淀，得到疏水性强蛋白质。 第27页28 2、亚细胞成份分离 亚细胞成份分离是指分离细胞中各种细胞器和亚细胞结构，如细胞核、线粒体、细胞骨架、核基质、核仁等，用于蛋白质组研究。这是最近蛋白质组学研究中兴起一个分支亚细胞蛋白质组学，它

13、不但可提升蛋白质检出效率，还能取得许多关于亚细胞结构和功效方面主要信息。 第28页293、激光捕捉显微切割技术（LCM） 1996年基因企业创造了一个称为激光捕捉显微切割（LCM）新技术，即在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞技术。它成功地处理了组织中细胞异质性问题,是分子病理学和肿瘤基因组学研究一项革命性技术 第29页30二、生物质谱技术与蛋白质判定（一）质谱基本原理质谱分析法（MS）是指在一定条件下，将样品分子电离成离子，然后经过测定这些离子质荷比（m/z）和强度来进行定性和定量一个分析方法。质谱分析法过程为：将样品气化并电离成带电离子，然后经过一定方法将不一样m/z离

14、子分开，并测定其强度，绘出质谱图，对质谱图进行分析可得到关于样品分子结构和定量方面信息。第30页31UB m v2 F= Bzv F Rm 离子源 S质谱方程 ：离子检测器图7-5 质谱仪原理第31页32有机分子受到电子轰击后，会断裂形成不一样各种离子，以离子质荷比m/z为横座标，离子强度为纵坐标作图，得到质谱图称为标准质谱图，也叫棒图。 第32页3310 0806040200204010 08060分子离子峰基峰相对强度（）质荷比（m/z)图7-6 质谱棒图第33页34 完整当代质谱仪由进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器、数据处理及控制系统五部分组成，另外还有一个保持质谱仪高真空度真空

15、系统。离子源和质量分析器是质谱仪最主要两个部件，也是不一样质谱仪主要差异所在。电喷雾质谱（ESI）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI）为离子源质谱技术已广泛应用于生物大分子研究，是蛋白质组学研究中不可或缺分析工具，所以被称为生物质谱（BMS）。 进样系统离子源质量分析器检测器数据采集及分析真空系统 （二）生物质谱 第34页35（三）蛋白质判定蛋白质样本经2-DE分离后，需对蛋白斑点进行判定，以确定其身份。利用取得蛋白质斑点各种属性参数，在蛋白质数据库中进行检索，寻找与这些参数相符合蛋白质。假如在数据库中搜寻不到，可能为新蛋白质，需用其它方法深入判定和研究。 第35页36蛋白质组学研

16、究需要有高通量蛋白质判定方法，MS技术能快速、准确地取得各种蛋白质属性参数，结合生物信息学工具，可快速进行蛋白质判定。所以，MS已成为蛋白质组学研究中不可或缺有力工具。下面介绍两种应用MS技术进行蛋白质判定方法。 第36页371、肽质量指纹图谱法 基本过程为：蛋白质混合物样品经过2-DE分离后，从胶上切下需要判定蛋白质斑点，用胰蛋白酶进行水解，胰蛋白酶在特定位点切割蛋白质，形成长短不一多肽混合物，用MALDI-TOF质谱仪对多肽混合物进行质量分析，得到肽片段质谱图，一个质谱峰代表一个肽片段离子。因为各种蛋白质一级结构不一样，胰酶水解后产生肽片段数目及质量均不相同，含有特征性，所以将得到肽片段质

17、谱图称为PMF。下列图为卵白蛋白PMF：第37页38第38页392、肽序列标签判定法 蛋白质由20种氨基酸组成，在蛋白质上随意选取一个四肽序列，依据概率论计算，另一个蛋白质上出现相同四肽序列概率为1/204，即1/160,000，所以从理论上说，只要测定一个蛋白质中56个氨基酸残基序列，就足以作为判别蛋白质特异性标签，称为肽序列标签。第39页40四、蛋白质相互作用研究技术蛋白质功效研究是一项艰难而又主要工作，它是说明生命现象本质必由之路。任何蛋白质，不论它是酶、抗原、抗体，还是信号转导分子，必须和其它蛋白质分子（或非蛋白质分子）在空间上相互靠近，形成某种相互作用，才能发挥功效作用。所以，研究蛋

18、白质相互作用对说明其功效含有主要意义 。第40页41酵母双杂交技术 1、基本概念 酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)是20世纪90年代早期发展出来一个用于研究蛋白质相互作用方法伎俩，它利用酵母细胞内真核表示系统，将两种外源蛋白质基因分别与酵母转录因子两个功效结构域融合，经过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型改变作为外源蛋白是否发生相互作用筛选标志。第41页422、基本原理酵母双杂交系统利用真核生物转录调控因子组件式结构特征。这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立结构域组成。DNA结合结构域（DNA binding domain，BD）和转录激活结构域（activat

19、ion domain，AD）是转录激活因子发挥功效所必须。单独BD能与特定基因开启区结合，但不能激活基因转录。而由不一样转录调控因子BD和AD所形成杂合蛋白却能行使激活转录功效。第42页43UASLacZ/His汇报基因表示X外源基因 BDGAL4 DNA-BD外源基因GAL4 ADADDNA-BD 质粒AD质粒表示表示融合蛋白融合蛋白图710 酵母双杂交原理图Y BDXYADYADRNA多聚酶 BDX第43页443.3 蛋白质组学研究意义及应用3.3.1 蛋白质组学研究意义3.3.2 蛋白质组学应用第44页45研 究 意 义DNA RNA 蛋白质存在3个层次调控转录水平调控翻译水平调控翻译后水平调控蛋白质存在复杂翻译后修饰，作为生命功效行使者，它比基因更能直接地反应生理过程及其改变。蛋白质相互作用及空间构向等问题是生命现象复杂性真实表达。第45页46疾病蛋白质组研究 病原微生物蛋白质组研究 蛋白质组在