细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒

1、细胞培养技术总结课杨晓明南通大学神经再生重点实验室与神经科学系细胞培养根本技术回忆细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感，这些物质假设有残留，会影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不残留任何物质浸泡：清水浸泡，可使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，生产及运输中，玻璃外表带有大量干固的灰尘，外表呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜以中和

2、碱性物质再次使用的玻璃器皿，常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求浸泡完全，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿外表附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿外表光泽度浸酸清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质；浸泡时器皿要充满清洁液；浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时。清洁液，常用三种：强清洁液，次强清洗液，弱清洁液 配制时应注意平安，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露局部配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为

3、棕红色冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗，不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满荡洗后倒净，最后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟以除掉培养中的蛋白质，自来水冲洗，蒸馏水冲洗 2 - 3次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，翻开包装即可用，多为一次性物品必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水

4、冲洗干净，晾干备用消 毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于在培养过程中每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台外表和不能使用其它方法进行消毒的培养器皿，30min湿热高压蒸气灭菌法：121，20min干烤：160, 2 小时过滤：0.22m化学消毒灭菌法70%酒精：操作者皮肤，操作台外表及无菌室内壁面处理；1新洁尔灭：器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素培养用液灭菌或预防培养物污染细胞培养常用试

5、剂细胞培养用水必须非常纯洁，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或超纯水 一、水二、细胞培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格廉价。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便常用的培养基种类RPMI-1640、高糖DMEM、低糖DMEM、F12 等细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购置细胞株时咨询。 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。

6、 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最正确培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 制备1000 ml DMEM培养基 DMEM干粉培养基 10.0 g1包及要求的NaHCO3量3.7g 参加细胞培养用水600 ml 磁力搅拌至完全溶解 加细胞培养用水定容至 1000 ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22 m孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成 100-200 ml/瓶，4保存备用。同时取少量做无菌实验。 使用前添加小牛血清至终浓度为10%，添加青霉素和链霉素至终浓度分别为100 U

7、/ml和100 g/ml，即为细胞培养用液。血清热灭活：56, 30 分钟加热已完全解冻的血清热灭活目的：灭活血清中的补体成分。适用于细胞因子和免疫相关实验，否那么建议血清不要灭活。因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后有时会严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm，5 分钟去除，也可不用处理；显微镜下“小黑点：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。

8、但如果疑心血清质量，那么应立即停止使用，更换另一批号的血清。平衡盐液体组织细胞培养中常用的根本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分用于洗涤组织、细胞等D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS)KCl0.40 gKH2PO40.06 gNaCl8.00 gNa2CO30.35 gNa2HPO40.048 gD-Glucose1.00 gPhenol Red0.01 gPBSPhosphate-Buffered Sallines KCl0.20g KH2PO4 0.20g NaCl8.00g Na2

9、HPO47H2O2.16gDPBSDulbeccos Phosphate-Buffered Sallines标准型CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙)0.10 gKCl0.20 gKH2PO40.20 gMgCl26H2O0.10 gNaCl8.00 gNa2HPO47H2O2.16 g消化液别离组织和分散细胞常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液单独或混合使用称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用平衡盐溶液配制，常用浓度为0.25% 0.1%-0.5%，搅拌使溶解彻底，可置室温4 小时，或冰箱搅拌振荡过夜，用碳酸氢钠溶液调pH 至7.2 左右。进行过滤除菌，分装入瓶中， -20保存

10、备用。胰蛋白酶溶液配制一、胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，参加血清或含血清的培养液，能终止消化作用EDTA4Na 溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便；常用工作液浓度为0.02%；注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长EDTA 溶液配制：用平衡盐溶液配制，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存。pH 调整液NaHCO3 溶液常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存HEPES分子量238.31溶液羟乙基哌秦乙硫磺酸，一种弱酸，无细胞毒性主要作

11、用：防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，假设加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。HEPES配制使用终浓度一般为10-50 mmol/L常配成1M 储存液：用20 ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。使用时可向100 ml培养液中参加2ml HEPES储存液，终浓度为20 mmol/L 谷氨酰胺补充液谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，4下放置7天即可分解约50%，所以都是在使用前添加配制好的培养液含谷氨酰胺

12、在4放置2周以上时，要重新参加原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，临用前参加培养液中；使用终浓度为1 4 mmol/L配制方法：一般配制为100倍储存液，浓度200 mmol/L29.22 g/L谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后应加温30，过滤除菌，分装，-20保存；使用时向100 ml培养液中参加0.5 2 ml储存液，终浓度为1 4 mmol/L 酚红大多数培养液中使用酚红作为pH 指示橙红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫红色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究说明：酚红能模拟类固醇激素尤其是雌激素样作用

13、抗生素溶液抗生素使用种类与浓度： 工作浓度 储存温度 杀灭细菌 penicillin (青霉素) 100 U/ml -20 G(+) streptomycin (链霉素) 100 ug/ml -20 G(+) , G(-) gentamicin (庆大霉素) 50 ug/ml -20 G(+) , G(-), 支原体amphotericin B (两性霉素B) 2.5 ug/ml -20 真菌nystatin (制霉菌素) 50 ug/ml -20 真菌器材和液体的准备细胞培养用的玻璃器材培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，160，2小时干烤灭菌后备用手术器材、瓶塞、配制好的PBS

14、液15磅，121，20分钟蒸气灭菌培养液、小牛血清、消化液抽滤后备用无菌操作中的本卷须知在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射20-30 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启超净台鼓风机运转10 分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，防止造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容器正上方操作实验。容器翻开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用 在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行冷冻保护剂目前常用的冷冻保护剂是DMSO(二甲基亚砜)，使用终浓度为5-10。但有些细胞系不能用DMSO作为冷冻保护剂，如人白血

15、病细胞系HL-60。因为，DMSO 能诱导HL-60 细胞分化。在这种情况下，可选用其它冷冻保护剂，如甘油glycerine，羟乙基淀粉(HES)等。特别注意细胞在冷冻过程中在-20冰箱内放置时间一般不要超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20这一步骤直接放入-80冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。DMSO 稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。DMSO 必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4保存。防止反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染时机。如要过滤DMSO，必

16、须选用耐DMSO的尼龙滤膜。哺乳动物细胞冷冻保存冷冻保存要点慢冻。4 3060 min- 20 30 min - 80 1618 h或过夜液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无污染。细胞浓度控制在：11075107/ml。常用细胞冷冻保存液10DMSO完全细胞生长培养液(20血清根底培养液)10甘油完全细胞生长培养液(20血清根底培养液)冷冻保存细胞的解冻与复苏要点快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化不要超过3 分钟；用1000转离心23 分钟，弃上清液；用510 ml 新鲜完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞；接种

17、细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml；24 小时后去除未贴壁的细胞，常规培养。细胞的原代和传代培养原代细胞培养原理细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。原代细胞培养操作鼠胎组织细胞培养为例取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪

18、开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，解剖胎鼠，取出待培养组织。切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，用平衡盐溶液清洗，至组织块发白为止。选择选择植块法或者消化法培养。 1.植块法培养：此时可直接将组织块接种至培养容器底部，至贴壁4-6h后加少许培养基培养； 2.消化、接种培养：静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。参加0.25胰蛋白酶消化液5-10倍量，与组织块混匀。室温消化，注意观察消化情况每隔几分钟摇动一下试管，静置，加完全培养基终止消化，离心，去上清，参加适量细胞培养液，用吸管吹

19、打混匀，移入培养瓶中培养。原代细胞培养实验结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层传代细胞培养原理体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层集合以后，由于密度过大生存空间缺乏而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，沉着器中取出，以1:2或l:3的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。细胞“一代指从细胞接种到别离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞可以倍增3-6次。传代细胞培养操作将长成单层的细胞从培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，用PBS轻洗细胞2 3次，可选用两种方法消化参加少许消化液(以液面盖住细胞为宜)，静置35分钟。参加适量消化液，使细胞全部浸没在消化液中后即移去，用残留在细胞间的酶消化。在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液吸去，参加35ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。将细胞悬液平均分至2 - 3个培养瓶中，并向每个瓶中分别补足适量培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。传代细胞培养结果一般情况，传代后的