总RNA的提取电泳鉴定及RTPCR

1、实验内容1、小鼠肝脏组织总RNA的提取2、RNA的琼脂糖凝胶电泳3、以RNA为模板进行RT-PCR4、 PCR产物的电泳及回收第一页，共二十八页。实验一. 提取小鼠肝脏组织的RNA第二页，共二十八页。一、真核细胞的总RNA 1、mRNA: 1-5% 5鸟嘌呤7位甲基化CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3poly(A)尾巴结构 20-200个A. 翻译所必需。 起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S:

2、18S=1874nt第三页，共二十八页。二、RNA提取的注意事项 RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1、 尽量避免外源性RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2、抑制内源性RNase 活性： RNase 抑制剂。 RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。第四页，共二十八页。1)发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将1 mL

3、Trizol 试剂移入Eppendorf管中。2)实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大, 放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 3)将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1 mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。三、RNA提取的实验操作 播放有声课件1: RNA提取方法及注意事项第五页，共二十八页。1、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作

4、，但价格经济。2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。RNA提取的几种方法室温孵育10 min介绍第六页，共二十八页。RNase抑制剂1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐) 最常用的RNase抑制剂: 与蛋白质中的组氨酸结合， 使蛋白质变性。 有效浓度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。用于浸泡各种器材。灭活条件：高压。 在Tris溶液中半衰期为1.25min。 试剂的配制:无R

5、Nase的溶液(用DEPC水配制, 高压) 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C ，或液氮中。2、肝素： 使用浓度：0.110mg/ml 效 果: 37 C 时，可抑制95%的RNase 活力。 如果与DEPC联合应用， 具有极强的抑制效果。第七页，共二十八页。5)加入200 l氯仿，震荡混匀20-30 s，室温放置5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）。6)10000 rpm， 离心 5 minRNA (清澈透明)DNAProtein7)将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。有声课件2: RNA干燥及溶解技巧第八页，共二十八页。8) 沉淀RNA： 加0.5 ml异丙醇，上下

6、颠倒混匀，室温10 min。 10, 000rpm，4C，离心10 min弃上清。) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。 (注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10) 7500rpm，4C 离心 1 min，弃上清 再离心几秒钟， 将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。第九页，共二十八页。11)室温干燥35 min （根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）注意事项：RNA:避免放在37 C孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干

7、燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pellet：透明胶样干燥后应该无色透明第十页，共二十八页。12） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5 l，加到RNA上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。13) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用(将用于电泳).14) 剩余 9 l溶液,放到冰上备用（将用于RTPCR）.注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，一定要用加样器反复多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶解。避免气

8、泡的方法：用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。第十一页，共二十八页。实验二. RNA 的琼脂糖凝胶电泳第十二页，共二十八页。 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解RNA 的琼脂糖凝胶电泳第十三页，共二十八页。 RNA样品： 4.5 l 上样缓冲液： 1 l 混匀后， 5.5 l 直接电泳上样（100伏，1030分钟） 上样前预电泳5min。 注意: 电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶

9、液需要灭RNA酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果RNA的电泳上样：第十四页，共二十八页。 RNA电泳结果 rRNA可以作为内部Marker分子，通过观察rRNA的两条带（28S和18S）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。 RNA电泳并不能判断mRNA是否提取成功，也不作为鉴定RNA提取质量的常规方法，因为在电泳过程中RNA可能发生降解。第十五页，共二十八页。 分析本次实验结果：28S、 18S和5S的比例。RNA电泳结果分析第十六页，共二十八页。实验三：逆转录反应及PCR（RT-PCR)第十七页，共二十八页。逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型3

10、7oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。逆转录反应原理AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h 逆转录有声课件3: RT 的原理和注意事项第十八页，共二十八页。 总RNA 9 l Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置

11、65水浴10min， 立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。第一步：打开RNA链之间的二级结构，使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。第十九页，共二十八页。 5RT-buffer 4 l RNasin (RNA酶抑制剂，40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV （逆转录酶） 1 l 轻弹管底混合。置42 oC 水浴1h。第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂第三步：将上述反应移至68 oC水浴10min以灭活 RTase，并冰浴，保存备用第二十页，共二十八页。午 休第二十一页，共二十八页。 PCR反应体系的建立 PCR 反应的进行 PCR产

12、物的电泳 结果观察与分析 PCR产物回收实验操作内容 有声课件（1）： PCR的基本原理及反应体系的组成PCR反应动画目的基因片断的体外扩增（2）：PCR 反应条件的确定及PCR常见问题的解决方案第二十二页，共二十八页。1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 l2）加入下列试剂,，顺序可以改变 10X PCR buffer (含MgCl2 ) 5 l dNTPs (10mM) 1 l 3 引物 (10mol/L) 1 l 5 引物 (10mol/L) 1 l 3）加去离子水 ，补足50l最终反应体系4）Taq DNA 聚合酶(2U/l) 1 l实验操作一、建立 PCR 反应体系3. 轻

13、弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下；4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。取 1 支200 l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中，用 Marker 笔 在管的侧面 标记；2. 依次加入下列试剂：第二十三页，共二十八页。注意：（1） PCR相关试剂均放在每排实验台上方中间位置处的蓝色 圆盒中 （2）加样的体积要准确，1 l 的体积不应该超过白色枪头的第一个格。 第二十四页，共二十八页。实验操作二、 PCR 反应的进行1、将样品放入 PCR 仪中2. PCR反应条件 94 30 S DNA变性 (Denaturation) 55 30 S 退火 (

14、Annealing) 72 45 S 延伸 (Extension) 上述温度变化进行 30 个循环 (cycles) 。 72 10 min (Further extension)。 3. 将同学们分成三组，分别观察PCR的温度循环。 其它同学课间休息。第二十五页，共二十八页。播放：有声课件 （PCR讲解1）播放：有声课件 （PCR讲解2）播放：PCR 动画第二十六页，共二十八页。实验操作 三、 PCR产物的电泳1. 教师指导学生将琼脂糖凝胶（1%）放入胶床上。2. 样品制备： 在50 l PCR产物中，加入 6 ul 上样液，混匀。 （上样液：10Loading buffer 或 6Loading buf