烟草实验操作手册

1、 102022一、 取样方法和测定指标：1、不同烤烟品种生理生化特征与烟叶质量风格特征争辩在生长特征观测的同时，从第 11 叶的叶长为 0.5cm 时算起，每个品种在 11, 10 天选取表现全都的典型植株(第一次取样40株,其次次取样20株,第三次取样10株, 连续采样至该叶位采收完毕)17叶的取样方法为: 170.5cm10天后开头取样,40 株,20 株,10 株，连续采样至该叶位采收完毕1 个叶片)11 17 位的叶片分别表示中部叶、上部叶，一局部叶片10 片叶，除去叶片的主脉在 105杀青(30h)此操作在咸丰县基地完成除-30的低温冰箱中待测，在华中农业大学植物生理试验室完成11

2、个指标。酶活性的测定： 磺胺比色法、谷氨酸/丙酮酸转氨酶、5-二硝基水杨酸显色法。有机成分的测定： 蒽酮显色法盐酸水解总3，5-二硝基水杨酸显色法凯式定氮法考、烟碱含量盐酸提取活性碳脱色法、游离氨基酸含量水合茚三酮比色法。2、特色优质烟叶关键栽培因子筛选生理指标分析 天, 现蕾 , 15 天, 30 天选取烟叶样后，分成上部叶、中部叶、下部叶。5 个处理中, 4 株(每个重复选取 2 株)长势长相具有代表性 叶, 中部烟叶中部的叶片和下部烟叶下1-5叶三局部。在田间快速放置在冰盒中带回武汉。酶活性的测定： 在试验室中， 测定单株各部位烟叶的鲜重后，将材料分2株烟株的上部、中部和下部叶片放置在-

3、20冰柜中保存。用NRGPTSSIN、苯丙氨酸解氨酶PAL活性的测定。有机成分的测定： 另一份2 个烟株于 105下杀青 20min，70下烘干至恒重。分别称量上部叶、中部叶和下部叶的干重。最终，测定淀粉、可溶N 和可溶性氨基酸含量。二、 酶活性的测定流程淀粉酶的测定过程王明媚一材料、仪器设备及试剂一材料 烟叶二仪器设备移液管，具塞刻度试管，1ml 移液枪，枪头三DNS 试剂：351g 20ml 1mol/L NaOH 中，50 ml 30g CO2进入。麦芽糖标液：称取麦芽糖 0.1000g 溶于少量蒸馏水中，定容至100ml 即为1mg/ml的麦芽糖标液。二试验步骤0.21% NaCl 8

4、 ml 研磨低温15mi，不时摇动。3000rpm 10min。待测：1ml 1淀粉(40度水浴中保温!)1ml。空白比照： 1ml 酶液，100 10min11 ml。准确记时DNS 2 5-10 min25ml520 nm 下比色。注：淀粉临时配制。1淀粉：1g 溶于 100ml 水中。管号麦芽糖含量mg麦芽糖标液ml蒸馏水mlDNS试剂ml0002.5管号麦芽糖含量mg麦芽糖标液ml蒸馏水mlDNS试剂ml0002.52.010.20.22.32.020.60.61.92.031.01.01.52.041.41.41.12.051.81.80.72.062.02.00.52.0淀粉酶总活

5、力mg/g min=(mg)淀粉酶原液总体积(ml)稀释倍数/样品重(g)测定时酶液用量(ml)反响时间(min)硝酸复原酶活力的测定离体法潘舒一试验原理-氨基苯540nm 有最大吸取峰。Ng/(g. h)为单位表示。二材料、仪器设备及试剂一材料 烟叶二仪器设备洗耳球，移液管，具塞刻度试管四亚硝酸钠标准溶液：取分析纯 NaNO20.9857g，溶于蒸馏水定容至1000ml，再吸取5ml 定容至1000ml。2.0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.5) ：取 Na2HPO412H2O30.0905g与 2. 4965 g1000ml。 浓盐酸加水定 3 mol/L HCL。0.02%萘基乙烯胺溶

6、液：0.0200g 100ml 蒸馏水中，贮于棕色瓶。0.1mol/L KNO3 溶液：2.5275g KNO3 250ml 0.1mol/L pH7.5 冲液。0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液 ：取 Na2HPO412H2O 8.8640 g 与 0.0570 g1000ml。0.1211g 0.0372g EDTA 溶于 100ml 0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液中。2mg/ml NADH2mg NADH1ml 0.1mol/L pH7.5配现用。三试验步骤一标准曲线的绘制7 2530min 540nm 下比色测定吸光度。以硝态氮g为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标

7、准曲线。管号1234567亚硝酸纳标准液/ml0.00.20.40.81.21.62.0蒸馏水/ml2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺/ml4.04.04.04.04.04.04.00.02%萘基乙烯胺/ml4.04.04.04.04.04.04.0每管含亚硝态氮/g0.00.20.40.81.21.62.0二样品测定酶的提取：0.5g，剪碎于研钵中, 30min，取出置冰浴, 4、4000rpm 5min，上清液为粗酶提取液。酶的反响：0.4 ml 10 ml 1.2 ml 0.1mol/L KNO 3溶液2530minNADH溶液，0.4ml 0.1mol/L pH7.5的

8、磷酸缓冲液代替。 1ml 萘基乙烯胺溶液，15min 4000rpm5min，取上清液测吸光值。四结果计算 g/(g h)(g)；V1为提取酶时参加的缓冲液体积(ml)； V2为酶反响时参加的粗酶液体积(ml)； W为样品鲜重(g);(h)。蔗糖转化酶测定3，5-二硝基水杨酸法张言芳一、仪器设备 ml，移液器，离心管和离心机，水浴锅，温度计，烘箱，滤纸，天平，25 ml 的具塞试管。二、试剂1 mg/ml 100 mg 105枯燥至恒重100 ml 容量瓶中，定容至刻度，摇匀。100g/LNaOH水溶液。DNS试剂： 3、51 g 20 ml 1 mol/L NaOH 中， CO2 进入。磷酸

9、盐缓冲溶pH6.0.1 mol/L N2HPO449.1 ml 和0.1 mol/L K2HPO450.9 ml 混匀。100 g/L 蔗糖溶液10 g 100 ml 容量瓶中，加10 ml 磷酸盐缓冲溶液pH6.二、试验步骤1、标准曲线绘制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml0、0.2、 葡萄糖6 25 ml 2.0 ml，3,5-1.5 ml5 min，取出后马上用冷水冷却至室温，再用水将各管定容至刻度。 比色皿，以试剂空白作参比，测定吸光度。依据测得的吸光度值绘制标准曲线或计算直线回归方程。2、蔗糖转化酶活性的测定 定容由后面的吸光值确定定容多少体积混合液：10 ml 10

10、ml 蔗糖溶液，混匀，吸取此混合溶液 5 ml，100 ml 容量瓶中。转化液：取混合液 8 ml 于 45水浴中转化 1 h，取出马上快速冷却至室温。1 ml25 ml2 ml，各加 ml5 min，取出后马上用水冷却至室温，520 nm 1 cm 作参比，测定吸光度。3、计算：N=n*A/W/V*200M=n*A/W/V*200蔗糖转化酶活性(mg/g)=10*2(M-N)式中：M转化后单糖(mg/g)N转化前单糖(mg/g)；A从标准曲线上查得的葡萄糖含量(mg)； W样品质量(g)；(ml)；N稀释倍数；(mg/g)1g mg数。蔗糖合酶孔霖一、试验原理UDPG+果糖-蔗糖+UDP这是

11、一个可逆反响，平衡常数为1.3-2.0。该酶在分解方向的Km值相对较高30-150mmol/，细胞中高的蔗糖浓度有利于反响向分解方向进展。蔗糖合酶活性测定既可在合成方向进展测定外加底物 UDPG 和果糖，测产物蔗糖的量表示酶活性，也可以在分解方向进展测定外加蔗糖和UPD酶活性。二、仪器设备及设备冷冻离心机，恒温水浴，分光光度计，研钵一套，磁力搅拌器，天平感量0.01m0.10.515 ml 移液管各110ml具塞试管105ml冰箱三、试剂配制提取缓冲液： 100mmol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液，内含5mmol/LMgCl2, 2mmol/L EDTA-N2,2乙二醇0.2% 牛

12、血清蛋BS2%PV5 DTT。透析缓冲液：25mmol/L液，内含2.5mmol/LMgCl2,1mmol/LEDTA-Na2,1%乙二醇，1mmol/LDTT。酶反响液：100mmol/LTris-HCl(pH7.0)缓冲液，内含10mmol/L果糖, 2mmol/LEDTA-Na25mmol/L 醋酸镁，5mmol/LDTT。10mmol/LUDPG:称取0.012206gUDPG，配成2ml，浓度计为 10mol/LUDPG,随配随用。2mol/L NaOH。30%HCl。0.1% 间苯二酚：0.1g间苯二酚溶于100ml 95%乙醇中，棕色瓶保存。1mg/ml蔗糖标准液。四、试验步骤酶

13、液制备： 称取1g 5ml 提取缓冲液，转离心20min。上清液3ml装入透析袋中，透析袋置和0.05ml透析后的酶液，补水至1ml。于30水浴中反响10min后，沸水浴3min UDPG。蔗糖含量测定：2mol/LNaOH0.1ml, 沸水浴10min 后，30%HCl3.5ml,0.1%1ml80保温10min。冷却后，480nm 处比色，测定蔗糖生成的量。标准曲线制作：取7支10ml具塞试管，并按下表参加各种试剂，按上述步骤3 以计算反响中蔗糖形成的数量。试剂1235671mg/mlml00.10.20.40.60.81蒸馏水ml10.90.80.60.40.20mg00.10.20.4

14、0.60.81A480结果计算：蔗糖合酶活力mg蔗糖/(g*FW*L)= C*Vt*n/(FW*t*Vs)式中：C 是从标准曲线查得的蔗糖量m；FW是样品鲜重g;t 是反响时间h；Vt 是提取酶液总体积ml；Vs 是测定时取用酶液体积ml；n 是提取液测定中的稀释倍数。【注】透析袋不行装满，以防止吸水涨破。【注】透析袋不行装满，以防止吸水涨破。谷氨酸/丙酮酸转氨酶的测定孔霖赖氏比色法(一) 方法原理GPT) 是植物体内最普遍的转氨酶,其催化下述反响:GPT :L - 谷氨酸+ 丙酮酸L- 丙氨酸+- 酮戊二酸GOT -酮戊二酸反响起催化作用,在肯定的反响条件下 产生肯定量的草酰乙酸 草酰乙酸随

15、之脱羧成为丙酮酸 Pyr) 。反响至规定时间后,2 ,4 - 二硝基苯肼及盐酸溶液 - ,生成丙酮酸苯腙。在碱性条件下,苯腙呈红棕色,其颜色深浅与丙酮酸含量在肯定范围内成正比 ,可用分光光500nm 波进步行比色,GOT 活度。酶粗提液中GPT 作用于基质中丙氨酸和- 酮戊二酸,生成丙酮酸及谷氨酸, ,4 - 二硝基苯肼及盐酸溶液终止反响,再按上法测GPT 活度。(二) 主要仪器与试剂1高速离心机, 恒温水浴锅, 722G分光光度计。20. 05mol/ L Tris - HCL 缓冲液(pH7. 2): 0. 2mol/ L 三羟甲基氨基甲烷(24.2g 200ml) 50ml 0. 2mo

16、l/ L HCl 44.2ml ,200ml 。0.1mol/L 磷酸盐缓冲液: 称取磷酸氢二钠(AR)11. 928g , 磷酸二氢钾(AR) ,1000ml 。2 ,4 - :称取 2 ,4 - 二硝基苯肼 19. 8mg ,用 10mol/ LHCL10ml 溶解后,100ml ,保存于棕色瓶中备用,3 个月。0.4mol/ L 氢氧化钠溶液:16g 氢氧化钠(AR)加蒸馏水溶解并定容至1000ml 。1 mol/ L :40g 氢氧化钠 (AR) 加蒸馏 水溶解并定 容至1000ml 。丙酮酸标准液(2mol/ ml) :22. 0mg 100ml 容量瓶中,0. 1mol/ L 磷酸

17、盐缓冲液至刻度。此液应颖配制。GPT 底物液: (DL - 200mmol/ L ,- 2mmol/ L) : - 1. 79g 置于一小烧杯中,0. 1mol/ L 磷酸盐(pH7. 4) 80ml 煮沸溶解后,待冷,1mol/ L pH 7. 4约 L 100ml 混匀,加氯仿数滴防腐,贮于冰箱内。酶粗制剂的提取 将颖植物材料剪碎,取鲜重 0. 2g 左右放入研钵,加 0.05mol/ L Tris - HCl 缓冲液(pH7. 2) 2. 0ml在冰浴中研磨,得到的匀浆用高速离心20220 g 20min ,上清液供测酶活度用。谷丙转氨酶( GPT) 活度测定 10ml 2 支,一支作测

18、定管,分别加酶粗 0. 5ml ,另一支作比照管,0. 1ml 37 ,30min 后取出,2 ,4 -0. 5ml 终止反响,比照GPT 0. 5ml 37 20min ,0.4mol/ L NaOH 5. 0ml混匀,10min 后用分光光度计比色,500nm ,蒸馏水调零点,得吸光度差值,查工作曲线即可查得丙酮酸体积(ml) ,0. 2ml 时应将酶粗制液稀释后,V(ml) 。工作曲线绘制: 取10ml 试管6 支,各管加0. 1mol/L 磷酸盐缓冲液0. 1ml , 5 、0.45 、0. 40 、0. 35 、0. 30 、0. 25ml丙酮酸标准) 各管加2,4 - 二硝基苯肼溶

19、液0.5ml混匀,再置3720min取出后各管加 L 5ml ,混匀,10min 后同上比色,读取各管吸光度。各管吸光度分别减去比照管吸光度,以各管丙酮酸体积为横座标,以相应的吸光度差值为纵座标绘制工作曲线。(四) 结果计算 内反响生成的丙酮酸微摩尔(mol) 表示。GPT mol/ g30min = (C V 20) / (m 2)式中,C 丙酮酸标准溶液的浓度(mol/ ml) ; V 由工作曲线查得的丙酮酸体积(ml) ;20 稀释倍数;2 反响时间换算系数, GOT 1h ,按习惯本法酶活性以 ;m 植物鲜重(g) 。苯丙氨酸解氨酶的活性测定王明媚一、原理苯丙氨酸解氨酶L-phenyl

20、alanine：ammonia lyase,简称 PAL；EC4.3.1.5 处有最大吸取值。假设酶的参加量适当，A290 上升的速率可在几小时内保持不变。通过测定 A290 PAL活力。 0.0l PAL的一个活力单位，相当每 1g肉桂酸。二材料、仪器设备及试剂一材料 烟叶二仪器设备耳球，移液管，具塞刻度试管，1ml 移液枪，枪头三0.lmol(pH8.8)。酶提取液：0.1mol/l 硼酸-硼砂缓冲液含 1mmol/lEDTA, 5mmol /L-巯基乙醇。0.02mol/l L-苯丙氨酸溶液0.1mol/L pH8.8。6mol/lHCl100g/ml 标准蛋白质溶液：准确称取 10 m

21、g 牛血清白蛋白于烧杯内，用蒸100ml 容量瓶内，定容至刻度，混匀。考马斯亮蓝 G-250称取 10mg 考马斯亮蓝 G-250,溶于 5ml95%85W/Vl0 ml 15ml 母85m1 蒸馏水的比例稀释，混匀后过滤即为稀释液。三、操作步骤5 倍体积的酶提取液，于冰浴上研钵研磨。10000g30min。离心后，取上清液，即为酶粗提液。量出其体积，放置冰浴中备用。酶活力测定：3 (0 号为比照管 )试管编号1230.1mol/l 硼酸缓冲液43.94.9酶液0.10.10.02mol/l 苯丙氨酸(ml)11401h0.2ml 6mol/1HCl l0 min,290nm 处测定各管的A2

22、90。(5) 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度。0.1ml5ml. 8 支，按下表参加各溶液：试管编号01234567(ml)稀释酶液mI蒸馏水ml020.21.80.41.60.61.40.81.21.0111考马斯亮蓝(ml)22222222A595。四、结果处理PAL活力的公式为PAL 活力式中：A290290nm的吸光值； Vt为提取液总体积mL；W为样品鲜重g； mL。蛋白质含量的公式为：(mg/g)C为查标准曲线值； mL；WF为样品鲜重g； VS为测定时加样量mL。15A595值为纵坐标，相应管中的蛋自质微克数为横坐标，作图。三、 有机成分的测定流程总氮的测定王明媚13mg为宜)，

23、用凯氏定氮仪测定。孔霖一、试验原理：炭的吸附作用脱色、烟碱对特定波长的光有吸取力量，测定烟碱的含量。二、测定步骤：待测液的制备：0.030 g100ml 1/3角匙的活性炭和 25ml 0.5N ml 的容量瓶中，洗三角瓶、合并滤液并定容摇匀待测。空白： 0.5N 25ml 盐酸参加容量瓶中，定容摇匀。测定： 以空白参比在分光光度计仪器上调读数为零，在 3 236nm，A。计算：烟碱% = 1.0592590.5236+282100100/W(1水3431000式中：1.059是校正系数；F是稀释倍数；V是待测试液体积；34.3 是烟碱的吸光系数游离氨基酸的测定茚三酮显色法潘舒一、原理氨基酸的

24、氨基可与水合茚三酮反响，产生蓝紫色化合物，其吸取峰在二、仪器设备及试剂配制一仪器设备漏斗。二水合茚三酮试剂： 0.6g 再结晶的15ml 9 ml pH5.4 的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶，4保存备用，10d内有效。乙酸-乙酸钠缓冲液pH5.4：称乙酸钠 54.4g，参加 100ml 超纯水加热至 100 ml30 ml 100 ml。标准氨基酸5g/l标曲用846.8m，溶于少量10%100ml, 5ml,50ml。0.1%抗坏血酸：50mg50ml 超纯水中，现配现用。三、试验步骤一标准曲线的绘制6 20ml 刻度试管，按下表参加试剂，混合均匀。80%乙醇定容至20ml。管号12

25、3456管号123456/ml0.00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0/ml3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸/ml0.10.10.10.10.10.1/g0.01.02.03.04.05.0二样品测定0.5g10min。1ml 20ml 1ml 超纯水。3ml 水合茚三酮试剂，0.1ml 0.1%抗坏血酸现配先用。20min80%20mL1cm 四结果计算*100C为查标准曲线值得氨基态氮含量 VT为样品稀释总体积ml； VS为测定时样品体积ml； W为样品鲜重g。注：重结晶。方法：5g 15ml 0.25g活性炭，轻轻摇动，假设太稠可加

26、水，30min后滤纸过滤，置冰箱过夜可见微黄结晶。用1 ml 蒸馏水洗结晶一次，置于枯燥器中枯燥后贮于棕色瓶。严格把握抗坏血酸的量。3. 4 考马斯亮兰法Bradford测总蛋白潘舒一试验原理考马斯亮兰 G-250 和465nm595nm。11000g，595nm 波长下的与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。二仪器设备及试剂配制一仪器设备分光光度计，研钵，烧杯，量瓶，移液管，具塞刻度试管。二试剂配制标准蛋白质溶液100g/ml 牛血清蛋白： 取牛血清蛋白 25mg 加水定容100ml40ml 100ml。G250 染料试剂： 100mg G250，溶于 50ml100 ml 85%W/V的磷酸，定容至1L。贮存棕色瓶，常温6 个月。三试验步骤一标准曲线的绘制管号123456标准蛋白质/ml0.00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml管号123456标准蛋白质/ml0.00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20/g020406080100考 G-20/ml5.05.05.05.05.05.0二样品测定5ml 蒸馏水研磨成匀浆。1ml1.0 mL至具塞试管中，参加5ml G-250 2 min 595nm 下比色，测定吸光度。通过标曲查蛋白质含量。四结果计算(mg/g)C为查标准曲线值； mL；WF为样品鲜重g； VS为