离子交换层析纯化蛋白质的工艺开发

1、离子交换层析纯化蛋白质的工艺开发离子交换层析分离蛋白的原理是基于其带电性的不同，通过蛋白质与带电荷的层析填料之间的静电作用力进行分离ANB Jlfof p H Pro pl 0 5 3* * P滞述的髦睜电礴离子交换箋析整仃质闸*白阳EC毘商馆合.嚴睹Vv.-MJ :HPifIEX有以下三类：阴离子交换层析(填料带正电荷，与带负电的蛋白质相结合)；阳离子交换层析(填料带负电，与带正电的蛋白质相结合)。复合型离子交换(填料配基基团中带有苯环，以离子交换作用为主，同时有一定 的疏水作用力)理论上来说，只要缓冲液pH值调节合适，所有的蛋白质都可以与阳离子交换柱和阴离子交换 柱结合。但是，蛋白质纯化过

2、程中，选择纯化条件和层析柱类型时最重要的考虑因素就是要保持蛋 白质的稳定，性。因此，选择哪一种离子交换层析和选择什么样的条件会影响蛋白质稳定性和活性是 必须要考量的。蛋白质与IEX的结合必须采用较宽pH值范围的溶液进行多次尝试以获得最合适的蛋白质保留 pH值oIEX的固定相是由惰性琼脂糖或者高分子基质与带电基团共价结合组成。介质微粒有很多尺寸，可以无孔，也可以有多种不同尺寸的孔。介质的选择主要根据所需的结合能力、分辨率和流速 要求来决定。介质颗粒尺寸越小，分辨率越高，但相应的流速也越低，分离时间也更长。多孔介质KMC 6FFWP-fiFFRjyW 比tt 爭.W-SfTll fISSP-AFF

3、 Ibl门閉r f俺主A-皇山4iiR摆油i：律犠咿平殛 /0L05I ffiStM * &25H 】. pH IT-fi4）i址硒I搏忧feCi, pH仃 欢屮抗転aK丄tal/mnEX中最常用的4种带电官能团如下所示。它们根据离子交换能力的强弱分类，强离子交换基 团可离子化的pH范围比弱离子交换基团的范围更大。阴离子交换（固定相带正电）：季钱（Q）强阴离子交换基团二乙氨乙基（DEAE） 弱阴离子交换基团阳离子交换（固定相带负电）：磺酸甲酯（S） 强阳离子交换基团竣甲基（CM） 弱阳离子交换基团因为强离子交换基团的活性基团在很大的pH范围内均可保持带电，它可以在蛋白质结合所需pH值 是特别强

4、的酸性或碱性的情况下使用（假设该pH值下蛋白质稳定性仍得以保持）。有些蛋白质在弱离子交换上的保留较弱，使得它们可以用较低的离子强度洗脱。由于 高离子强度会影响部分蛋白质的稳定性，而弱离子交换不需要在极端的pH值条件下进行蛋白质的结合，因此可能对蛋白质更合适。离子交换色谱的固定相首先用低离子强度的缓冲液平衡，然后将蛋白质样品用和平衡过程相同 离子强度的缓冲液上样到固定相。结合的蛋白质在用更高离子强度或pH值不同的缓冲液洗脱前先淋洗一段时间。洗脱缓冲液中的抗衡离子与带电的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白质。在离子交换层析中，某些盐类代替结合蛋白和保持蛋白质稳定性的能力，可能比 其他种类的盐可能更有

5、效。NaCI或KCI是洗脱液中最常用的盐类，其中Na+或K+是阳离子交换层析中的抗衡离子，CI是阴离子交换层析中的抗衡离子。另 一方面，还可以通过调节缓冲液的pH值来减少蛋白质的电荷并破坏其与固定相之间的相互作用。对于结合到阳离子交换固定相上的蛋白质，增加缓冲液pH值会使蛋白质所带正电荷减少，因此可将其从柱上洗脱下来。对于结合到阴离子交换固定相上的蛋白 质，降低pH值可减少蛋白质所带负电荷将其从柱上洗脱下来。同时，还可以调节缓冲液的pH值使目标蛋白质不与离子交换固定相相结合，而与此同时杂蛋 白与固定相结合。如此，可在穿透液中收集目标蛋白质，而杂蛋白通过与固定相结合得以去除。与 其他层析方法相比

6、，离子交换层析在确定蛋白质结合、洗脱和获得足够高的分辨率的最佳条件时可 能需要解决更多的问题。离子交换层析纯化蛋白质工艺开发过程层析填料一一吸附层析工艺幵发运用DOE实豔设计法快速鳥逸歸选:快建祎选野合适的绕合填科嘴罡制步的结合杂件中试跤大阖定因素：填料里号 吁吕戎蛊肚屮过拧线 叶建大氐素：條容DOE 冋吹梓綁席蜡合载亞等层析填料一一吸附层析过程填料裝壌及測甘致洗棹課存蔽去热原轟装柱和课先用纯水或者低浓度缓邓谨即 可也可在装柱丽潭冼后再脱气装柱DO曲竽I维持良好的皓合条供株品却料味搔焕并箱台洗出对庆未皓舍养物待将单杭从柱底：法辰卞来恢却康有功龟淮掉柱床中再生液 使用芸独水Y：纯度.收率,处理渭

7、莓用W MaOH.保 iA20*Z,fl|/10mM MEOHJ 四玉出醇*氓穿摆式洗脫时可不用拉梯度大多数蛋白可依据pl快速选择离子交换填料缓冲液pH目的蛋白pl 0.5-3个单位选择弱阴离子交换填料(DEAE)缓冲液pH目的蛋白pl 3个蛋白以上选择强阴离子交换填料(Q)缓冲液pHW目的蛋白pl 0.5-3个单位选择弱阳离子交换填料(CM)缓冲液pHW目的蛋白pl 3个单位以上选择强阳离子交换填料(SP)缓冲液中含有较高离子强度时选择复合型离子交换填料(MMC/MMA)根据pl选择只能做为参考，不能完全依据pl选择，因为蛋白是局部电荷和离子交换填料以静电力的形式结合。根据离子交换填料的粒径分布选择，原则上粒径越小分辨率越高。快速捕获选择流速大的(BB 165-300um)初步纯化选择粒径适中的(FF45-165