基因克隆载体 (3)讲稿

1、关于基因克隆载体 (3)第一张，PPT共三十七页，创作于2022年6月第二节 病毒（噬菌体）克隆载体病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 噬菌体:感染细菌的病毒 分类（根据病毒与宿主的关系）温和性病毒： 溶原性增殖构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖改造后 第二张，PPT共三十七页，创作于2022年6月噬菌体的电子显微镜照片一、噬菌体克隆载体第三张，PPT共三十七页，创作于2022年6月DNA + 外壳蛋白 1、DNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)（一） 噬菌体性质第四张，PPT共三十七页，创作于2022年6月在噬菌体内呈线性双链DNA分子(4850

2、2bp)在两端各有12个碱基组成的5单链互补粘性末端(Cohesive end )；进入宿主细胞后，粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)。（DNA连接酶）第五张，PPT共三十七页，创作于2022年6月2、噬菌体基因组有基因61个以上J与N、P与Q之间为非必需序列第六张，PPT共三十七页，创作于2022年6月迄今已经定位的噬菌体基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的调控（必需基因）；另一部分基因则被称为非必需基因；当它们被外源基因取代后，不影响噬菌体的生命周期。由外源基因取代非必需基因所形成的重组噬菌体DNA，可以随寄主细胞一起被复制和增殖。第七张，PPT共三十七页，创作于20

3、22年6月3、 限制性核酸内切酶位点: 56种4、 噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径宿主合成int基因产物-DNA整合到染色体DNA上 某种胁迫条件下合成six基因产物-DNA脱离细菌染色体溶菌第八张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（二）构建依据 1、噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 野生型DNA头部可包装约36.451kb(自身的75%105%)，且约有20kb DNA可缺失（生长非必需） 3、在DNA上有多种限制性内切酶位点 第九张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（三）构建的基本策略与技术路线 策略: 切去部分非必需区删掉多余的限制性内切酶

4、位点插入选择性标记基因建立体外包装系统第十张，PPT共三十七页，创作于2022年6月技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以gtWES 为例，EcoRI（48.5kb） DNA E co R I 6个片段 第十一张，PPT共三十七页，创作于2022年6月B片段是噬菌体生长非必需的； C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 两端EcoR I别点经点突变或甲基化处理，即得gtWES：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb）克隆能力： 替换B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40

5、.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（p109,表3-5） 4.9kb21.6kb5.5kb7.5kb5.9kb3.3kb第十二张，PPT共三十七页，创作于2022年6月 2、在DNA的非必需区内插入选择标记基因（1）自然筛选（51kb或36.4kb不能包装）（2）插入选择标记基因 取代red和gam基因野生型噬菌体(Spi+表型) 在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长 （red、gam基因）外源DNA取代 获Spi-表型 在P2噬菌体溶原性细胞中能生长 red、gam基因 局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 最常用的筛选标记：Lac Z基因第十三张，PPT共三十七页，创作

6、于2022年6月3、建立重组DNA分子体外包装系统体外重组DNA分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。野生型噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。D-（D基因缺失噬菌体）受体细胞积累除D蛋白以外所有蛋白质E-（E基因缺失噬菌体）受体细胞积累除E蛋白以外所有蛋白质混合 D、E互补 包装DNA分子 噬菌体 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-)第十四张，PPT共三十七页，创作于2022年6月第十五张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（四） 噬菌体克隆载体的应用 1、建立c DNA基因文库 转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程

7、。效率高。转染(transfection) 指真核细胞主动或者被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。2、克隆外源目的基因第十六张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（五）重组DNA分子的体外包装（自学）1、溶原菌BHB2688(E- )和BHB2690(D-)的检验2、制备包装物3、体外包装第十七张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（一）构建策略 由质粒和含cos位点的DNA片段组装成的载体，即cosmid克隆载体,又叫粘粒; 或：cosmid克隆载体是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。是噬菌体质粒混合物。二、cosmid克隆载体（柯斯质粒载体） 第十八张，PP

8、T共三十七页，创作于2022年6月（二） cosmid的特征 1、环形双链DNA分子,36.4kb,一般10kb 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制 3、含有一个cos位点 A蛋白 cos末端体外包装成为噬菌体，但不含噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统，不会产生子代噬菌体第十九张，PPT共三十七页，创作于2022年6月4、cosmid较小，可承载更大的外源DNA 若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。第二十张，PPT共三十七页，创作于202

9、2年6月（三）柯斯克隆(Cosmid cloning) (1)定义 应用柯斯质粒作载体，在大肠杆菌寄主细胞中克隆大片段的真核基因组DNA的技术，叫做柯斯克隆。这个定义的三个要点是：a.柯斯质粒作载体；b.大肠杆菌为寄主;c.克隆大片段的真核基因组DNA。第二十一张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（2）理论依据a.在phage线性DNA分子的每一端都具有彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端(cos位点)b.phage的多连体分子是由cos连接而成的。cos cos cos cos cos cosc.末端酶(treminase)或叫Ter体系即phage具有一种位点特异的切割体系(si

10、te-specific cutting system).A蛋白*此系统能识别两个相距适宜的(36.451kb)cos位点，并切割之。*根据上述分析可知phage DNA包装的两个必要条件是：cos位点、Ter体系（A蛋白）第二十二张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（3）柯斯质粒包装条件 由于只有在被作用的DNA分子具有两个cos位点，而且它们之间距离保持在36.451kb的条件下，Ter体系才能对它发生作用。据此推断： 柯斯质粒是不能作为包装体系的，因为它只有一个cos位点。因此：柯斯质粒只有在同适当大小的外源DNA片段重组成具有两个cos位点而且相距达36.451kb之间时，才能被包

11、装。第二十三张，PPT共三十七页，创作于2022年6月 利用Cos质粒进行克隆 第二十四张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（四）使用cosmid载体的基本程序 利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的噬菌体性质转导受体细胞（下图）第二十五张，PPT共三十七页，创作于2022年6月三、M13噬菌体克隆载体（单链丝状噬菌体载体 ）第二十六张，PPT共三十七页，创作于2022年6月含复制起始位点及可插入外源DNA的位点 （一）M13 DNA 环状单链DNA分子（“+”链DNA） 大小：6.4kb 结构：10个区 基因间隔区（IS区）第二十七张，PPT共三十七页

12、，创作于2022年6月（二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖 M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌 合成“-”链产生双链M13 DNA（复制型DNA或RF-DNA） 按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转译包装蛋白 RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链 结果只能以“-”链为模板合成“+”链 “+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体 挤出受体细胞 受体细胞不被溶菌。第二十八张，PPT共三十七页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共三十七页，创作于2022年6月第三十张，PPT共三十七页，创作于2022年6月M13 DNA

13、复制特征：以双链DNA为中间媒介 培养物高速离心上清中含噬菌体颗粒“+”链DNA 沉淀菌体破碎后，可提取RF-DNA 第三十一张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（三）M13噬菌体克隆载体的构建策略和途径 策略：在RF-DNA的IS区插入选择标记基因，并组装合适 RF-DNA上有10个BsuI位点部分酶切获得全长线形RF-DNA, 与含LacZ标记的Hind酶切片段进行平末端连接M13mp1载体。为获得合适的克隆位点,可在Lac Z区插入连杆 构建成对M13载体，保证外源DNA两条链都能随“+”链一起复制包装。第三十二张，PPT共三十七页，创作于2022年6月HindBHH第三十三张，PPT共三十七页，创作于2022年6月（四）M13克隆载体的优点与应用 优点： 1、以双链环形DNA为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作 2、制备的M13 DNA单、双链都能转化大肠杆菌，直接转染受体细胞