基因工程的四部曲

1、基因工程的四部曲 1应用DNA探针技术可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基 因的存在及其完全表达 ()2自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程 ()3转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加 ()4国际上大多数国家 都在转基因食品标签上警示性注明可能的危害 ()5每个普通质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 ()6 外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制 ()答案1. 2. 3. 4. 5. 6 . 自我检查1、 基因工程操作步骤： 。（1）获取目的基因的方法有 。（2） 是关键步骤，基因表达载体的组成： 。 一、自主导学：

2、获取目的基因、制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）、受体细胞的转化与筛选、目的基因的检测与表达通过基因文库获取、PCR技术扩增、人工合成（反转录法和化学方法合成），真核生物常用 人工合成 方法。基因表达载体的构建目的基因、启动子、终止子和标记基因等（3）受体细胞的转化与筛选：基因工程中常用的受体细胞 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。动物常把 细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有 等；农杆菌转化法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的 上，导入动物细胞的方法有 ；如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用 处理，以增大细菌 的通透性，使含有目的基因的重组

3、质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于 ，在很短的时间内就能够获得 。受精卵农杆菌转化法染色体DNA显微注射法CaCl2细胞壁细菌繁殖的速度非常快根据受体种类不同，选择的受体细胞也不同，为什么？大量的目的基因（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用 方法，用 方法检测目的基因是否转录，用免疫（ ）法检测目的基因是否表达。另外也可进行个体水平检测。如 。2、基因拼接成功的原因_ 。 转基因表达成功的原因是生物 。基因工程的意义： 。DNA分子杂交DNA与RNA杂交抗原抗体反应让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态脱氧核苷酸且遵循碱基互补配对原则共用一套遗传密

4、码目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：人(人胰岛素)大肠杆菌(无胰岛素基因）人的胰岛素基因与载体（DNA)结合导入大肠杆菌细胞获取分离发酵培养(含胰岛素基因)胰岛素（抗性检测与鉴定）Insulin（Levemir ）诺和诺德公司研制 glargine （Lantus）安万特公司研制胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？1.获取目的基因(1)从基因文库中获取目的基

5、因(2)利用PCR(多聚酶链式反应)技术扩增目的基因在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。包括：变性、退火、延伸三部曲变性(95):双链DNA解旋成为单链DNA退火(55):部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸(72):以目的基因为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成互补的新DNA链PCR缓冲溶液中：目的基因、4种脱氧核苷酸、两种引物、 耐高温的DNA聚合酶、能源物质(3)人工合成目的基因基因比较小，核苷酸序列已知，可以通过DNA合成仪人工合成DNA 二、理解基因工程的四部曲相同点：都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区构成。不同点：

6、原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。真核，原核生物基因比较：编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子外显子内含子编码蛋白质（不能编码蛋白质）真核生物基因结构限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomic library) 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。目的基因的获取1.基因文库目的基因的获取cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育

7、时期细胞内的mRNA经体外逆转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库 2)cDNA文库 (cDNA library)基因重组逆转录酶mRNAcDNA基因的剪刀限制性核酸内切酶（分子手术刀）一种酶识别并切割一种特定的核苷酸序列G A A T T CC T T A A GGC T T A AA A T T CG黏性末端限制性内切酶限制性内切酶（1）利用限制酶和DNA连接酶如何构建基因表达载体？2、构建基因表达载体单酶切-先用同一种限制酶目的基因和质粒，再加入DNA连接酶单酶切-先用同一种限制酶目的基因和质粒，再加入DNA连接酶质疑探究质

8、粒质粒连接物目的基因-目的基因连接物目的基因质粒连接物质粒自身环化目的基因自身环化质粒自身环化 质粒 目的基因目的基因自身环化质粒质粒目的基因目的基因单酶切 变 双酶切（用两种酶分别切割目的基因的两端和质粒）为了防止目的基因和质粒在酶切后末端发生任意连接，酶切时应选用两种酶切割，从而保证目的基因和载体定向连接。（2）目的基因与质粒相互连接成基因表达载体的结构基础是什么？AGCTATGC平面结构双螺旋结构a、一个完整基因表达载体由哪几部分组成？各部分结构有什么功能？b、启动子与起始密码、终止子与终止密码一样吗？（3）如何针对基因表达载体进行加工和改造才能实现目的基因的稳定存在和高效表达？目的：使

9、目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代使目的基因能表达和发挥作用。复制原点：目的基因：启动子：终止子：标记基因：控制合成目的蛋白质是RNA聚合酶识别和结合的部位,启动基因转录出mRNA终止转录鉴别与筛选导入目的基因的受体细胞组成标记基因一定是抗性基因吗？DNA的复制的起始位点 标记基因用于检测目的基因是否导入成功的原理是什么？启动子与起始密码、终止子与终止密码一样吗？编码区非编码区非编码区启动子终止子编码蛋白质起始密码终止密码mRNA启动子(DNA片段)起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)终止密码子(RNA)3、受体细胞的转化与筛选思考：受体细胞的类型？转化方法？为什么需要筛选？

10、如何筛选？筛选重组细胞(1)筛选的原因：不是所有的受体细胞接纳了重组DNA分子，只有部分受体细胞中含有目的基因。(2)筛选的方法：利用标记基因。 DNA分子 目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定基因结构原核生物 真核生物方法从基因文库中获取人工合成PCR技术扩增 DNA复制操作工具组成过程限制酶DNA连接酶载体目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞DNA结构基因工程应用转基因动物、植物、微生物基因工程药物基因诊断、基因治疗转基因食品、生物的安全性发展蛋白质工程基因工程知识联系不同来源DNA重新组合的过程实质基因重

11、组优点：定向改造典例分析（选修模块3：现代生物科技专题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有 、 、 三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 。目的基因载体连接物目的基因-目的基因连接物分离纯化载体-载体连接物青霉

12、素抗性基因四环素抗性基因（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ； 若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 。（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_。载体-载体连接物载体-载体连接物目的基因-载体连接物启动子mRNAEcoRI和BamHI青霉素抗性基因四环素抗性基因例题：（9分）下图是利用生物工程技术生产人生长激素的示意图。质粒上的Ampr表示青霉素抗性基

13、因，Tetr表示四环素抗性基因，限制酶PstI、EcoR I和Hind 切割形成的末端均不相同。据图回答：（1）将人生长激素基因导入小鼠体内来生产生长激素。图中对供体雌鼠甲用促性腺激素处理一段时间后与雄鼠乙交配，然后通过手术的方法从雌鼠甲的_中取出受精卵。图中早期胚胎应保证发育到_阶段，才能进行后续过程的操作。（2）过程不能利用人的皮肤细胞，其原因是_。（3）为了使目的基因和质粒定向连接并且有利于受体细胞的筛选，切割质粒时应选用的酶是 。（4）大肠杆菌细胞内应不含 基因，以利于筛选出含重组质粒的受体菌。（5）如果从限制酶Pst I、EcoR I和Hind任选两种酶对质粒进行切割，均会将质粒切成两段，则形成的DNA片段有_种，其中含有完整四环素抗性基因的DNA片段占_。（6）按照图示