深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研

1、王广科,李明春,李晋川,刑来君1质料与要领11植物质料绥农10和吉林47等两个精良品种，由吉林省农科院大豆研究所提供。12菌株与质粒AgrbateriutuefaiensLBA4404，由中科院微生物所方荣祥老师奉送。pGA643Kanr，由内蒙古大学哈斯阿古拉传授惠赠。pTIL6Apr全长ID6DDNA，南开大学真菌实行室保存。13重要试剂14造就基的配制LB、YEB、S及SB造就基配方拜见文献10。15抗生素与激素的配制配制要领拜见文献10。16植物表达载体的构建及农杆菌的转化17农杆菌的造就从保存的农杆菌平板上挑取含有表达载体的单菌落，接入含有50g/LKan、25g/LRif、25g/

2、LStr的YEB造就基中，28，145r/in振荡造就。挑取无病斑且种皮齐备的大豆种子，净水浸泡留宿后去种皮，置于1/2SB或S固体造就基造就，几天后得到无菌苗。切取子叶节外植体并制造伤口并农杆菌菌液熏染，熏染后置于幼芽固体造就基中诱导分化出芽。待抗性芽在伸长造就基中长到34后转到生根造就基中，1520d后可得到大豆转基因抗性小植株，当根充实发育后，将幼苗移栽到花盆。抗性再生苗在花盆里两个月开始结籽，劳绩后，对部门子1代的种子举行脂肪酸构成和含量的测定，别的种子种于温室中，即为T1代转基因植株。19转基因植株的PR检测110转基因植株的Suthern检测111转基因大豆脂肪酸的气相色谱G阐发取

3、一粒转基因阳性大豆种子，提取脂肪酸后举行气相色谱G阐发，气相色谱测定由南开大学中央实行室完成。2效果与阐发21植物表达载体的构建22预处置惩罚对诱导从生芽的影响在子叶节外植体得到后，转移到预造就基中培表1预处置惩罚对大豆丛生芽诱导的影响养2436h，然后举行农杆菌的熏染。同时以未经预造就基造就和在预造就基造就140h的子叶节诱导从生芽举行比力可知：未经预造就基造就的子叶节要比颠末预造就2436h的子叶节推延35d摆布出现从生芽。将子叶节预造就140h，那么子叶节诱导丛生芽率会急剧落落见表1。缘故原由大概是短时间的预造就有助于暗语细胞进入伤口修复反响，产生必然数目的愈伤，而长时间在诱导愈伤造就基

4、上预造就，拦阻了细胞进一步分化生长，加速了细胞的老化及褐化历程，因此使诱导丛生芽率不竭落落见图2。23T1代转基因株系的莳植及被转基因的遗传生根的转基因抗性苗莳植到造就土中见图3，颠末约20d后开始结荚见图4，1个半月后从T0植株上劳绩T1种子，但种粒一样平常比正常的籽粒小，按株系莳植在花盆中。种子的萌发率约为80%，全部萌发的种子都着花结荚。每个株系别离单株取叶片提取DNA举行PR扩增以检测被转基因的遗传，农杆菌介导的大豆子叶节转化效果见表2。24转基因植株的PR检测使用TAB法提取大豆转化抗性再生苗T0代表2农杆菌介导的大豆子叶节转化效果现实转化率=T0PR阳性数/外植体总数100%.Re

5、alfrequeny=T0/Ttalexplant*100%.和T1代叶片中的总DNA，以质料和要领中的PR反响条件举行扩增，电泳检测。效果在吉林47和绥农10共120棵抗性再生植株中，有75棵此中24棵吉林47和51棵绥农10，扩增出了约1.37kb的目的带，而未转化的比较那么无此目的带，PR阳性率为63.07%.现实转化率为1.00%(见图5、6)。25斑点杂交阐发提取部门PR检测阳性的转基因植株叶片的总DNA举行斑点杂交见图7。26Suthern杂交阐发27转基因大豆的脂肪酸的气相色谱G阐发把颠末斑点杂交和Suthern杂交检测断定为阳性的转基因植株的种子单粒研磨，举行脂肪酸提取，甲酯化

6、后，举行脂肪酸的G阐发。271吉林47转基因大豆的脂肪酸的阐发由尺度品GLA见图9A，比较吉林47未转化植株的种子见图9B和转化植株的种子见图9比力可知：图A所示转基因大豆中出现了一个特别峰，出峰时间为12.578in，与尺度品GLA的出峰时间12.632in相对应，而比较未转化植株的种子中没有这一特别峰，说明深黄被孢霉的D6D基因在转基因大豆吉林47中得到表达，其表达量占总脂肪酸的6.047%.GLA的出现与亚油酸含量的低落呈显着的同等干系，比较种子中亚油酸含量为54.244%，而转基因大豆的种子中，亚油酸含量别离为51.010%和48.987%.272绥农10转基因大豆的脂肪酸的阐发由尺度

7、品GLA见图9A，比较绥农10未转化植株的种子见图9D和转化植株的种子见图9E和图9F比力可知：图9E所示T1代转基因大豆中出现了一个特别峰，出峰时间为12.593in，与尺度品GLA的出峰时间12.632in相对应，比较未转化植株的种子中没有这一特别峰，说明深黄被孢霉的D6D基因在T1代大豆中得到表达，其表达量占总脂肪酸的5.678%.图9F所示T2代转基因大豆中出现了一个特别峰，出峰时间为12.598in，其含量为6.226%，说明深黄被孢霉的D6D基因在转基因大豆绥农10中可以或许不变遗传。GLA的出现与亚油酸含量的低落呈显着的同等干系，比较种子中亚油酸含量为57.376%，而转基因大豆的种子中，亚油酸含量别离为54.088%和53.313%.3讨论别的，在使用农杆菌介导的植物转基因研究中，较小的表达载体更利于转化服从的进步，在以