植物细胞微丝束的光学显微镜观察实验原理及步骤

1、实验五：植物细胞微丝束的光学显微镜观察【课前预习】1为什么本实验中考马斯亮兰R250 染的是微丝？2实验中的各种试剂分别有何作用？【目的要求】掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。【基本原理】细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100 处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250 染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。微丝、微管和中间纤维都是直径很小的结构，最大的单根微

2、管才25nm 左右，只能在电镜下才能观察到。目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微镜技术。本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。由于细胞经TritonX-100 抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100 处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存， 再用考马斯亮兰R250 染色，使

3、得胞质中细胞骨架得以清晰显现。【实验用品】1材料：新鲜洋葱鳞茎2试剂1） M 缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为：50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)； 0.5mmol/L MgCl26H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)2） 6mmol/L PBS 磷酸缓冲液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:33） 0.7% NaCl 生理盐水4） 1% Triton

4、X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-缓冲液5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL6） 0.2% 考马斯亮蓝R250 染液 200mL：考马斯亮蓝R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸馏水46.5mL3仪器：光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片【方法步骤】【实验结果】洋葱鳞茎外层与内层的表皮细胞比较（放大倍数1020）洋葱鳞茎内层的表皮细胞骨架【实验报告】1光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？2请设计一个实验鉴定你所观察到的细胞骨架是哪一类型。附：各种主要试剂的作用1Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂；适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存2M缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压3EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2，主要是高浓度的Ca2可是微管解聚，因此加