蛋白表达系统的选择课件

1、 蛋白质表达系统的选择大肠杆菌表达系统转录翻译基因表达系统DNA蛋白质RNA逆转录调控调控中心法则基因表达系统转录翻译基因表达系统DNA蛋白质RNA真核生物表达系统基因表达系统原核生物表达系统其它基因表达系统酵母 植物昆虫哺乳动物细胞. .无细胞系统 胚细胞. .原核表达系统结构原件原核生物表达系统原核生物受体细胞原核表达载体大肠杆菌芽孢杆菌链霉菌蓝藻原核表达系统结构原件原核生物表达系统原核生物受体细胞原核表达载体大肠杆菌DNA复制及重组载体的选择系统原核表达系统结构原件大肠杆菌表达系统原核生物受体细胞原核表达载体选择标记复制子选择标记大肠杆菌表达系统复制子是一段包含复制起始位点和反式因子作用

2、区的DNA片段。 大肠杆菌基因表达载体一般是质粒表达载体，有效的复制子包含在质粒中使转化体产生新的表型，以便于将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来显性标记选择标记大肠杆菌表达系统使转化体产生新的表型，以便于将转化了的细胞从大量的菌群中分离出来营养缺陷标记氨苄青霉素抗性四环素抗性链霉素抗性氯霉素抗性卡那霉素抗性在适当的诱导条件下可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列 抑制基因大肠杆菌表达系统启动子种类: 诱导型启动子,Lac、Trp、PR tra组成型启动子,T7噬菌体的启动子是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功

3、能产生抑制作用防止产生不必要的转录产物，控制目的基因mRNA的长度，提高 mRNA稳定性，避免质粒上其它基因的异常表达使转录在目的基因之后立即停止，避免多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列 大肠杆菌表达系统终止子是原核基因转录起始位点下游的一段DNA序列 大肠杆菌表达系统大肠杆菌中表达真核基因或本身所含SD序列较弱的原核基因，必须从外部同时提供启动子和有效的SD序列。SD序列大肠杆菌表达系统翻译终止密码子与核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落下来，终止蛋白质的翻译过程 终止密码子 起始密码子是翻译的起始位点，通常为AUG（编

4、码met），是首选的起始密码子。有极少数生物利用其它密码子作为翻译的起始密码子，如GUG、UUG等起始密码子劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异 源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定已发展为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列Thank you2013.01.08植物表达载体Ti质粒表达载体Ti质粒Ti质粒 为植物根癌土壤杆菌菌株中存在的质粒，其特定部位与植物核内DNA组合来表达

5、信息，使植物细胞肿瘤化。Ti质粒是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中。这段DNA序列叫做T-DNA序列。Ti质粒的结构Ti质粒可以分为4个区：（1）T-DNA区（transfer DNA region,转化DNA区）（2）Vir区（virulence region,致病区）（3）Ori区（orign of replication 质粒复制起始区）（4）Con区（region encoding conjugations,结合转移区） 其中，T-D

6、NA可以整合到植物细胞染色体上。由于T-DNA上的基因带有植物细胞可识别的表达调控信号，因此它能够依赖植物细胞中的RNA聚合酶II进行转录。Ti质粒的转化过程T-DNA的边界在T-DNA区的两端有一个25bp的正向重复序列，这两个片段是高度保守的。其中右边界的序列是至关重要的。如果右边界的序列发生突变，会使T-DNA的转移功能彻底丧失或者是大大降低；但是如果突变左边序列则影响比较小。实验证实，只有T-DNA两端的序列存在并且方向正确，那么在两序列之间插入任何一个DNA片段都有可能被转移整合到植物基因上去。在Ti质粒转化植物细胞时，Ti质粒携带的外源DNA可达50kb以上。对T-DNA区改造的具

7、体方面切除致癌基因增加能插入外源DNA的单一限制酶切位点。插入选择性标记基因装配高效启动子和转录终止信号Ti载体系统（双元载体系统）双元载体是由两个质粒组成。一个是不含有T-DNA的Ti质粒，提供Vir功能；另一个是具有广宿主范围的小质粒，带有T-DNA两侧末端重复序列以及选择标记基因、克隆位点等等。小质粒重组了外源的DNA后，从大肠杆菌转导农杆菌，再去感染植物细胞。农杆菌感染植物细胞的方法（1）叶圆片法：用打孔器打取几毫米直径的叶圆片，表面消毒，进入农杆菌液数秒后，置于适当培养基上培养2天，再转到含有卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基上培养20天，通过脱分化、再分化长成新的含有目的基因的植株。

8、（2）整株感染：在无菌培养的整株植株的适当部位上人工造成伤口，用农杆菌液接种，待形成肿瘤后切下，在含有抗生素且无激素的培养基上进行培养并除菌。（3）原生质体和农杆菌共培养法：将除去细胞壁的原生质体与农杆菌共培养，然后再分化细胞壁、脱分化、再分化得到含有目的基因的植物植株。 酵母表达系统Concept 酵母表达系统的产生 酵母表达系统的组成 主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点 酵母表达系统的方法123451.酵母表达系统的产生 基因工程技术的发展为用微生物合成和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多种蛋白。大肠杆菌表达系统存在若干缺陷：A：缺少真核生物的蛋白

9、翻译后修饰和加工B：表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复 杂的复性才能恢复构象和活性C：背景杂蛋白很多、纯化起来麻烦D：表达量一般不是很高1979年，为了克服大肠杆菌表达系统的缺点，发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母。 1981年,Hizeman等人首次报道了人重组干扰素基因在酿酒酵母中表达并获成功。酵母表达系统的优点：A.可以大规模生产，有效降低了生产成本B.收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定C.很容易纯化2.酵母表达系统的组成宿主质粒载体自主复制型质粒 选择标记外源基因表达的相关元件3.主要酵母表达系统酿酒酵母表达系统乳酸克鲁维亚

10、酵母表达系统 甲醇营养型酵母表达系统裂殖酵母表达系统3.1甲醇营养型酵母表达系统甲醇作为唯一的能源和碳源 表达载体：整合体型载体筛选标记：组氨醇脱氢酶 基因HIS4启动子：AOX1作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列我国酵母表达载体产品结构分析毕赤酵母系统模式表达载体5AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达;-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； HIS4为营养缺陷型筛选标志；3AOX

11、1 基因片段能够与基因组AOX1基因同源重组；抗Amp基因和pBR322复制起始位点，使载体可在E.coli中筛选和复制。外源蛋白在酵母菌中表达的一般步骤:（1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有酵母启动子和转录终止子的表达框中；（2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产物；（3）外源蛋白在特定培养条件下合成；（4）外源蛋白的纯化与及其天然产物的比较。3.2 高效表达特性高效产生的关键因素表达载体受体菌：蛋白水解酶缺陷型整合型表达载体甲醇氧化酶启动子pAOX1 醇氧化酶-1（AOX1）的终止子3AOX1 酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列甲醇营养型酵母表达系统的主要优点： A.应用AOX启动子，

12、转录效率高，易于诱发调控B.表达质粒易于整合到基因组,不易丢失,适于高度 发酵,产量高C.表达产物分拣进入过氧化物酶体,利于工业生产和分离纯化D.对分泌蛋白的糖基化修饰和糖基化程度适中甲醇营养型酵母表达系统的主要不足：A.甲醇不适于食品工业生产B.易发生火灾ThankYou!昆虫表达系统Insect Expression昆虫表达系统用重组杆状病毒在昆虫细胞系中表达外源蛋白目前应用较多，对果蝇等昆虫进行稳定转化后可以获得稳定性和表达效率方面更为优异的表达系统。目前已经利用昆虫表达系统成功地表达了鼠源单克隆抗体、人一鼠嵌合抗体、单链抗体、人单克隆抗体及抗体融合蛋白等基因工程抗体分子，这些抗体分子多

13、数能正确组装，完成糖基化过程，具有相当的活性。 (一)以重组杆状病毒为载体的昆虫表达体系多数杆状病毒表达载体的构建过程大体如下：将目的基因克隆入合适的转移载体用重组的转移载体和相应的野生性或改造过的野生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞用噬菌斑分析分离并鉴定阳性重组体 扩增病毒以进行大规模的蛋白生产纯化所表达的外源蛋白 多核多角体病毒(MNPv)是应用最广的杆状病毒载体该病毒基因组为共价闭合环状双链DNA，长80200kb，1，组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配 2，具有与高等生物相似的蛋白翻译后的加工修饰能力3，表达水平高，可达总蛋白量的50%； 4，可容纳大分子的插入片

14、段； 5，能同时表达多个基因。外源蛋白的表达的影响因素高质量的培养基是获得高效表达的前提，昆虫细胞培养要求相对较高的氧浓度，应使细胞具有高度活性并维持在对数增长期。除此之外，使用的载体、启动子、前导肽以及所表达外源基因的特性也会对表达水平产生影响。（二）稳定转化的昆虫表达系统用适当启动子驱动外源基因对昆虫进行稳定转化寄主细胞通常来源于双翅目昆虫，包括来自果蝇的Schneider2和Kc以及来自白纹伊蚊(Aedeslbopictus)的C7等细胞系。对其它属的昆虫，特别是杆状病毒载体常用的鳞翅目昆虫的转化报道极少。将嵌合的蚕丝蛋白轻链一绿色荧光蛋白基因序列装入杆状病毒转移载体后完成了对家蚕的转化并定位于基因组的蚕丝