分子生物学染色体与dna市公开课获奖课件

1、第2章 染色体与DNA第一节 遗传基本单位基因第二节 原核生物基因结构特点第三节 真核生物基因结构特点第四节 DNA复制第五节 DNA损伤与修复第六节 DNA转座第1页第1页 复制（replication）：遗传信息从亲代DNA传递给子代DNA过程，称为复制。一、 DNA复制基本特点二、 DNA复制几种主要形式三、 原核生物DNA复制特点四、 真核生物 DNA复制特点五、 DNA复制调控第四节 DNA复制第2页第2页 半保留复制(semi-conservative replication) 复制高保真性(high fidelity)双向复制(bidirectional replication)

2、半不连续复制(semi-discontinuous replication) 一、DNA复制基本特点（普通特性）第3页第3页DNA半保留复制 概念：当细胞分裂DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为两股单链，并各自作为模板，用以指导子代合成新互补链。这样在子代细胞出现新DNA双链中，其一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则是完全重新合成，且与母链按碱基配对原则互补。也就是说两个子细胞DNA双链，都和亲代母链DNA碱基序列完全一致，这种复制方式称为半保留复制（semiconservative replication) 。第4页第4页DNA半保留复制证据含15N-DNA 细菌第一代培养于普通培养

3、液第二代培养于普通培养液普通DNA沉降位置普通DNA重DNA重DNA密度梯度离心结果15N- DNA14N- DNA第5页第5页 半保留复制意义 通过半保留复制，子代保留了亲代DNA所有遗 传信息。 DNA分子中遗传信息通过转录和翻译（基因表示）决定细胞蛋白质结构和功效，即DNA通过复制和基因表示决定了生物特性和类型，从而表示了遗传过程相对保守性。 遗传信息相对稳定，是物种稳定性分子基础。 在强调遗传恒定性同时，不能忽略 其变异性。第6页第6页A TG CA TA TC GT AT AA TG CA TA TC GT AT AA TG CA TA TC GT AT A通过半保留复制，子代和亲代

4、DNA完全一致第7页第7页 从复制原点到终点，构成一个复制单位，叫复制子复制时，解链酶等先将DNA一段双链解开，形成复制点，这个复制点形状象一个叉子，故称为复制叉 复制起点、方向和速度第8页第8页 领头链(leading strand)：顺着解链方向连续复制链。 随从链(lagging strand)：与解链方向相反不连续复制 链。55555333领头链随从链解链方向复制方向与解链方向关系复制叉DNA半不连续复制 双向复制与半不连续复制第9页第9页复制叉复制叉第10页第10页复制方向和速度： 单起点、双向等速多起点、双向等速第11页第11页二、DNA复制几种主要形式1、型复制大肠杆菌DNA在复

5、制时可形成类似希腊字母形状。（一）线性DNA双链复制 （二）环状DNA双链复制 第12页第12页3-OH5-P3-OH5-P 2、滚环复制 第一阶段：以亲本单链（）为模板，合成 互补链（），形成闭合双链环状复制形。第二阶段：滚环复制。一个负链能够合成许多 正链，正链用于噬菌体包装。是单向复制特殊方式。如：174双链环状DNA复制型（RF）第13页第13页（1）模板链和新合成链分开;（2）不需RNA引物，在正链3OH上延伸（3）只有一个复制叉; 第14页第14页dNTPDNA-pol 3、D环复制: 也单向复制一个特殊方式。 首先在动物线粒体DNA复制中被发觉。第15页第15页第16页第16页（

6、一）DNA双链解旋1、DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)： 简称拓扑酶Topo. 种类：分型、型、型、型。 作用：改变DNA分子拓扑构象，使DNA超 螺旋结构松弛，克服打结，配合复制。 三、原核生物DNA复制特点第17页第17页解链过程中正超螺旋形成第18页第18页 拓扑异构酶型作用特点 ：大肠杆菌中Topo主要是松弛负超螺旋，而对正超螺旋无作用，故在复制叉行进中不起作用；但真核生物Topo对负超螺旋及正超螺旋都有作用。切断DNA双链中一股；Topo对单链DNA 亲和力比双链高得多，这是它辨认负超螺旋DNA分子基础。互补链通过缺口，适当初候又把切口封闭；不消耗ATP。 第1

7、9页第19页拓扑异构酶作用第20页第20页 拓扑异构酶型作用特点： 在无ATP时，切断DNA双链两股，未断DNA双链穿过缺口，在ATP供能时将切口封闭。在模板复制起始点附近使DNA引入负超螺旋，这 对于复制引起是必要。在复制延长过程中，Topo可松弛复制叉前方 正超螺旋，以利于复制叉行进。复制末期，处理母链与新链打结。第21页第21页2、DNA解链酶(DNA helicase): 解链酶有各种，包括大肠杆菌解链酶、DnaB蛋白或Rep蛋白等。它们在起始点上结合并打开DNA双链，此过程消耗ATP。 解链酶多延随从链以53 方向移动，只有Rep蛋白延前导链以3 5方向移动。 DnaA蛋白辨认复制起

8、始点，DnaC蛋白辅助解链酶。第22页第22页3、单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) SSB也称螺旋反稳定蛋白(helix destablizing protein, HDP)。 其作用是在复制中维持模板处于单链状态，并保持单链完整。 大肠杆菌SSB是由19KD亚基构成四聚体，对单链DNA亲和力强。第23页第23页 解开双链分别与SSB结合，结合范围8-16个核苷酸。 SSB对单链DNA亲和力强，而对双链DNA及RNA亲和力弱。 原核生物中，SSB与DNA结合表现出协同效应。第24页第24页 原核生物DNA只有一个复制起始点，

9、称Ori C (origin C)。大肠杆菌DNA复制起始时，Dna A辨认并结合Ori C，并且Dna A只与处于负超螺旋状态下DNA相结合。 复制起始时，模板起始部位DNA负超螺旋构象 形成，主要由Topo引入。 DNA复制必须以单链为模板，大肠杆菌解链酶 分解ATP取得能量，将双链解开。（二）DNA复制引起第25页第25页E.coli复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209

10、 237 245 串联重复序列 反向重复序列5353 复制起始点第26页第26页双链解开、复制起始第27页第27页大约20个DnaA蛋白在ATP作用下与oriC处4个9bp保守序列相结合第28页第28页在HU蛋白和ATP共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp串联重复序列变性,形成开链第29页第29页解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链第30页第30页第31页第31页 引起前体生成：引起前体(preprimosome)包括有各种蛋白质因子，其中至少包括Dna A、 Dna B、Dna C。 复制起始时Dna A作用： Dna A辨认并结合Ori C中四

11、个9mer，形成 20-30亚基起始复合物。 Dna A促使Ori C中三个富含AT13mer局部发 生解链，形成解链复合物，此过程有ATP参与。 Dna A引导Dna BDna C复合物进入局部解链区， 形成引起前体复合物，之后Dna B发挥解链酶 作用，继续解链。第32页第32页引物（primer）合成： 引物酶 复制是在一段RNA引物基础上进行，催化引物合成是一个RNA聚合酶，它不同于催化转录过程RNA聚合酶，故称为引物酶(primase)。 大肠杆菌引物酶又称为DnaG蛋白，是一条60KD多肽链。引物酶在模板复制起始部位催化互补碱基聚合，形成短片段RNA。 第33页第33页 引起体 D

12、naA、DnaB、dnaC蛋白，尚有其它复制因子一起形成复合体，结合到模板DNA分子上，再结合引物酶(DnaG)，形成较大聚合体，这种复合物称为引起体。 引起体下游解开双链，再由引物酶催化引物合成。引物为何是RNA而不是DNA？ 不同生物RNA引物及结构不同，动物细胞RNA引物约由10个核苷酸组成，第一个核苷酸常为ATP，原核生物RNA引物由数十个核苷酸组成，第一个核苷酸常为GTP 。第34页第34页 复制起始 DNA拓扑异构酶在复制起始部位将DNA引入 负超螺旋。 DnaA蛋白辨认、结合于起始位点9mer处，并 促使13mer局部解链。 DnaB与DnaC复合物进入，生成引起前体，然后 Dn

13、aB继续发挥解链作用。 SSB与解开单链结合，稳定和保护单链。 引物酶(DnaG)进入并与引起前体结合生成引起 体。 引起体中引物酶催化NTP聚合，生成引物。 DNA拓扑异构酶(型为主)在解链前方理顺DNA 链，松弛正超螺旋。第35页第35页 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶引物酶SSB3535引起体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为引起体。 第36页第36页第37页第37页 前导链(leading strand)：顺着解链方向连续复制链。 后随链(lagging strand)：与解链方向相反不连续复制链。 冈崎片段(Okazaki

14、fragment): 随从链上不连续复制片段 称为冈崎片段。55555333领头链随从链解链方向复制方向与解链方向关系复制叉DNA半不连续复制（三）冈崎片段与半不连续复制-链延伸 第38页第38页（四）复制终止 基因组中能独立进行复制单位称为 复制子(replicon)， 每个复制子中含有一个复制起始点和一个复制终止点。 原核生物染色体只有一个复制起始点，故有单一复制子； 原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片段在复制终止点(ter)处汇合。第39页第39页oriC ter100/03282oriCter猿猴病毒SV40复制起点和终点180oE.coli复制起点和终点第40页第40页双链环状

15、、型复制、双向等速第41页第41页5 55555 5 5OHPpol53外切酶pol53聚合酶dNTP连接酶ATPADPPi不连续片段 连接DNA连接酶应用：在复制中起最后接合缺口作用。在DNA修复、重组、剪接中也起缝和缺口作用。基因工程主要工具酶之一。第42页第42页（五）原核生物DNA聚合酶 种类：大肠杆菌中存在DNA聚合酶、 DNA聚合酶活性： 三种酶都有DNA聚合酶活性，且都需要 模板和引物，但DNApol对底物亲和 力最高，聚合方向为53 。第43页第43页 35外切酶活性： 三种酶都有，但DNApol 活性最强。 这种酶活性是基于对不配对碱基造成 单链辨认，故对复制保真性至 关主要

16、。 DNApol 利用35外切活性切除错配碱基，同时利用53聚合活性补回正确核苷酸，这种功效称为即时校读(proof read)。第44页第44页碱基配对正确，DNApol 无活性3-5外切活性5-3聚合活性DNApol AGdCTPCG5353DNApol3-5外切与即时校读功效 53外切酶活性： DNApol 有 53外切酶活性，可切除引物。第45页第45页 三种聚合酶分子结构： DNApol为单一肽链，分子量103KD，由A-R共18个-螺旋肽段构成。 DNA-pol 经特异蛋白酶水解可产生大、小两个片断。 小片段由323个氨基酸残基构成，含有53外切酶活性； 大片段由604个氨基酸残基

17、构成，分子量68KD，含有53聚合酶活性及35外切酶活性，是进行分子生物学研究惯用 工具酶，大片段也称klenow片段(klenow fragment)。第46页第46页DNApol 结构 第47页第47页 53外切酶活性 35外切酶活性 聚合酶 活性NC小片段Klenow 片断DNApol 三个活性中心 DNApol由4个以上亚基构成， 分子量90KD。第48页第48页 DNApol 分子量为900KD，全酶由10种(、 、)22个亚基构成不对称二聚体； 关键酶包括、亚基；亚基分别催化领头链与随从链合成； 亚基有35外切酶活性及对碱基选择功效，亚基为装配所必需； 亚基起着夹住模板又能使酶延模

18、板滑动作用。第49页第49页第50页第50页A： E.coli DNA聚合酶是不对称二聚体 B：E.coli DNA聚合酶由18个-螺旋构成第51页第51页 DNA-pol DNA-pol DNA-pol分子数/细胞 400 40 100 1020比活性 低于pol 比pol大15倍以上分子量 103KD 90 900KD分子结构 单一肽链,有A至R 4个亚基 10种、22个亚基 共18-螺旋肽段 为不对称二聚体53聚合活性 53外切活性 35外切活性 对底物亲和力 低 低 高功效 校读 不清楚 在复制延长中 填补空隙 修复合成 催化新链合成 切除引物大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶和

19、主要在SOS修复中发挥作用。第52页第52页第53页第53页第54页第54页阶段一阶段二第55页第55页阶段三阶段四第56页第56页第57页第57页DNA链延长 聚合反应以母链为模板， 按碱基配对原则指导新链合成。 以四种dNTP为原料。 原核生物DNApol 全酶两个不对称亚单位 中关键酶分别催化领头链与随从链合成。 dNTP5-P是聚合到已有3-OH端， 形成3-5磷酸二酯键。 DNA复制方向性，53方向。 由于DNA两股链走向相反，因此复制时新链 也按相反走向延长。第58页第58页(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 第59页第59页 聚合反应特点以亲代DNA单链

20、为模板DNA 新链生成需引物；遵循碱基配对规律（A=T，GC） dNTP为原料5 3方向延长第60页第60页领头链合成第61页第61页随从链合成第62页第62页四、真核生物DNA复制特点1、真核生物DNA分子较大，且与组蛋白紧密结合， 因此复制 前要先有核小体解开，此时 DNA分子中胞嘧啶C-5甲基化，有助于染色体 解聚。复制后，DNA又要与组蛋白结 合形成 核小体。2、真核生物有各种DNA聚合酶，且酶活性较低， 但酶含量大。（一）复制起始点及方向：第63页第63页原核生物真核生物引物长度 数十个 约10bp冈崎片段 1000-bp 100-200bp3、真核生物染色体上有多个复制起始点，形成

21、 多个复制子，它们相距5-300kb。 比如人染色体平都有100个复制点， 可同时在200个复制叉上进行复制。4、真核生物引物及冈崎片段长度小于原核生 物。第64页第64页53oriorioriori535533553复制子3 真核生物复制子第65页第65页第66页第66页 DNA-pol（引物酶活性）； DNA-pol（解螺旋酶活性）； 拓扑异构酶，松弛超螺旋； 复制蛋白(replication protein A， RPA)。 稳定单链作用。 真核细胞复制起始需要因子： 第67页第67页（二）真核生物DNA聚合酶五种： DNA-pol : 参与链合成引起。 DNA-pol ：在没有其它DN

22、A-pol时才发 挥作用，或参与修复。 DNA-pol ：参与线粒体DNA(mtDNA) 复制。 DNA-pol ：复制延长中起作用。 DNA-pol ：复制过程中起校读、修复 作用。第68页第68页真核生物五种DNA聚合酶比较DNA pol 5-3聚合作用 3-5外切活性 5-3外切活性 分子量(KD) 300 179-230 250 40 180-300细胞内定位 核 核 核 核 线粒体功 能 引物 DNA链 复制 损伤 线粒体 合成 复制 修复 修复 复制第69页第69页3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体 真核生物链延长需要： DNA pol催化新链延长；增殖细胞核抗原（P

23、CNA） 提升DNA pol在模板上行进能力。第70页第70页53355335+5333355（三）末端复制与端粒酶第71页第71页 端粒(telomere)概念： 指真核生物染色体线性DNA分子末端结构。 结构特点 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 末端DNA序列是富含T、G短 序列多次重复。人端粒DNA序列是TTAGGG。TTAGGGTTAGGG1、端粒复制：第72页第72页 稳定染色体结构 预防染色体末端融合 保护染色体结构基因避免遗传信息在复制过程中丢失 端粒功效：第73页第73页1930，著名遗传学家 B.Mcclintock 和HJ.Mller发觉：染色体末端可维持染色体稳定性M

24、ller将它定义为“telomere”，这是由希腊语“末端”（telos）及“部分”（meros）构成染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一块，发生结构及功效上改变，从而影响到细胞分裂与生长 端粒发觉第74页第74页1970，EH.Blackburn 利用四膜虫揭示 了端粒DNA初步结构：由非常短且数目准确串联重复 DNA 片段 构成，富含嘌呤G。结构：一条链Gn（T/A)m，互补链Cn（A/T)m。 n1，m为14。重复次数由数千到数万不等 端粒DNA结构共同特点第75页第75页 不同生物端粒DNA序列 人：（TTAGGG）n ，串联重复，515kb酵母：（TTTTGGGG）， 200 40

25、0 bp尖毛虫：TTTTGGGG ， 20 bp小鼠： 5 80 kb大鼠： 150 kb第76页第76页2、端粒酶(telomerase)端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 构成 是一个RNA-蛋白质复合物。在端粒DNA 复制上，端粒酶既有模板、又有逆转录酶 这两方面作用。第77页第77页 端粒酶结构第78页第78页端粒酶催化延长作用爬行模型第79页第

26、79页DNA聚合酶复制子链进一步加工第80页第80页 端粒酶与药物（1）针对端粒酶RNA或端粒酶逆转录酶mRNA设计反义寡核苷酸药物 阻断端粒DNA合成或端粒酶逆转录酶表示。 如：肽核酸（PNA）是一个非常有前程药物。（2）核酶 ： 直接作用于端粒酶RNA锤头状核酶。 （3）端粒酶逆转录酶克制剂： 如：3-叠氮胸苷 （4）其它：核苷类似物、端粒酶蛋白抗体等。第81页第81页五、DNA复制调控1、大肠杆菌染色体DNA复制调控大肠杆菌DNA复制与细胞分裂不直接偶联；复制起始不依赖于细胞分裂，但复制终止则能引起细胞分裂。DNA复制调控主要发生在起始阶段，一但开始复制，如没故意外阻力，就能够复制到完毕

27、。大肠杆菌复制起始点有OriC和OriH两种，其中OriC是首选复制起点。第82页第82页 真核生物DNA复制与细胞 分裂与是密切配合。 原核生物生长速度快，DNA复制要通过细胞周期中较多时期。 真核细胞DNA复制只发生在细胞周期S期(DNA合成期)。 在S期中，核内DNA复制进行一次，并且仅此一次。G1G2MS开始 分裂开始真核生物细胞周期2、真核细胞DNA复制调控 第83页第83页 真核细胞DNA复制调控发生在3个水平：（1）细胞生活周期水平：限制点调控 决定细胞停留在G1期，还是进入S期。（2）染色体水平调控：决定不同染色体或 同一染色体不同部位复制子按一定 次序在S期起始复制。（3）复

28、制子水平调控：决定复制起始是否。 这种调控从单细胞生物到高等生物是高度 保守。第84页第84页第五节 DNA损伤与修复 突变概念、意义和类型 突变原因 DNA损伤修复系统第85页第85页（一）突变（mutation）概念： 是指DNA碱基序列发生可遗传 任何永久性损伤。 包括自发突变和诱发突变。一、突变概念、意义和类型 遗传物质DNA并不像人们想像那么 稳定，它在细胞各种内外环境原因影 响下，可不断地出现损伤(damage) DNA碱基序列及构成改变 。第86页第86页 （二）突变意义 1、突变是生物进化分子基础2、突变造成基因型改变3、突变造成死亡4、突变是一些疾病发病基础第87页第87页（

29、三）突变类型（1）点突变（point mutation）：即碱基错配 点突变主要特点之一是含有很高回复突变率。转换：同型碱基改变； 即嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶改变。颠换：异型碱基改变； 即嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤改变。包括1、依据DNA碱基序列改变进行分类：点突变：又分为单点突变和多点突变第88页第88页HbA 基因HbS 基因CTCCACGAGGTG 镰形红细胞贫血病人Hb为HbS 正常成人Hb为HbAHbS=226 gluvalHbA 肽链 N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链 N-val his leu thr pro val glu C(14

30、6)第89页第89页（2）碱基插入（base insertion） 是指一个本来没有碱基或一段本来没有核苷酸插入到DNA大分子中间。（3）碱基缺失（base deletion） 指一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分 子上消失。第90页第90页（4） 重 排概念：DNA分子内发生较大片段互换， 称为重组或重排。由基因重排引起两种地中海贫血基因型位于11号染色体上Hb基因加族 111222Hb Anti-Lepore Hb Lepore第91页第91页NNOOCH3NNCH3OOHHRRP（5）二聚体形成常见T-T C-T C-C第92页第92页 框移突变（frame-shift mutation

31、）：插入或缺失造成三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列次序发生改变，其后果是翻译出蛋白质可能完全不同。2、对阅读框架影响：第93页第93页5 G C A G U A C A U G U C 丙 缬 组 缬 G A G U A C A U G U C 谷 酪 蛋 丝实线：本来密码读法虚线：缺失C后密码读法第94页第94页 同义突变(synonymous mutation)：是指没有改变产物氨基酸序列密码子改变，即与密码子简并性相关。3、依据对遗传信息改变情况进行分类： 错义突变(missense mutation)： 指碱基序列改变引起了产物氨基酸序列改变。 有些错义突变严重影响蛋白质功

32、效，会产生致死性突变。 有些错义突变基本不影响蛋白质功效，称为中性突变。 中性突变与同义突变一起被称为无声突变。第95页第95页 无义突变(nonsense mutation)： 是指某个碱基改变使代表某种氨基酸密码子变为蛋白质合成终止密码子，使肽链合成过早终止。因而蛋白质产物普通没有活性。4、依据突变表现型对外界环境敏感性分类：（1）非条件性突变：nonconditional mutation（2）条件性突变： conditional mutation 最常见条件性突变为温度敏感突变。第96页第96页 回复突变（back 或 reverse mutation）： 突变体失去野生型性状能够通过

33、第二次突变得到恢复，第二次突变叫回复突变。5、依据突变效应是否背离野生型进行分类： 正向突变（forward mutation）： 指改变了野生型性状突变。 回复突变能够使本来突变基因序列回复 正常，这是真正回复突变，此情况很少。 如： GGAGUAGGA第97页第97页 克制突变能够发生在正向突变基因之中，叫作 基因内克制突变； 大多数是第二次点突变并没有改变正向突变 DNA碱基序列，只是其突变效应被克制了， 这种第二次回复突变称为克制突变 (suppressor mutation)。也能够发生在其它基因之中，叫作基因间克制突变。6、依据影响基因调控序列进行分类：启动子上升突变：突变增强启动

34、子活性；启动子下降突变：突变减少启动子作用。第98页第98页（一）DNA自发性损伤 自发突变（spontaneous mutation）复制错误引起损伤，在DNA损伤中最为多见。人体约有1014细胞，每一细胞有4109碱基，一生中约经1016次细胞分裂，因此发生复制错误机会诸多。 复制错误最多见于尿嘧啶(U)渗入， 另外偶有其它碱基渗入。二、突变原因1、DNA复制错误第99页第99页大肠杆菌碱基错配率10110235校读105106错配修复109预计人类错配率为108实际为10101011各种修复机制第100页第100页 DNA修复合成又称DNA非程序性合成 (unscheduled DNA

35、Synthesis, UDS)。 DNA修复合成DNA聚合酶不同于DNA 复制DNA聚合酶，它催化DNA修复 合成一样能够发生碱基配对错误，造成 DNA突变。2、DNA修复合成第101页第101页3、碱基自发改变（1）脱氨基： 即胞嘧啶、腺嘌呤及鸟嘌呤环外氨基 自发丢失。 胞嘧啶尿嘧啶； 腺嘌呤次黄嘌呤； 鸟嘌呤黄嘌呤。 脱氨基所至碱基转变可影响DNA复制， 由此产生突变。第102页第102页（2）碱基丢失： 即脱嘌呤或脱嘧啶作用。 是指DNA上丢掉了嘌呤碱或嘧啶碱，形成 无碱基位点，称为AP部位 。 (apyrimidine，apurine site , AP) 在生理状态下，脱嘌呤是脱嘧啶

36、20倍。 据预计，一个哺乳动物细胞在37条件下，20小时可有10000个嘌呤碱和500个嘧啶碱自发水解。碱基丢失后脱氧核糖3端磷酸二酯键易被水解，造成DNA链断裂。第103页第103页 细胞进行生物氧化时不断产生氧 自由基，可引起DNA氧化损伤， 造成DNA链断裂。其断裂产物 可从尿排除体外。4、正常代谢产物对DNA损伤第104页第104页（二）环境原因引起DNA损伤 诱发突变 （induced mutation） 1、物理原因： 包括紫外线(UV)、x射线、射线等各种辐射。2、化学物质： 烷化剂：使DNA分子嘌呤碱基尤其是鸟嘌呤烷 基化，包括N7、N3、O6及磷酸骨架位置。 羟胺类； 亚硝酸

37、盐； 碱基类似物，如5-BU。第105页第105页第106页第106页哺乳动物细胞双链DNA(61012)损伤频率损伤种类损伤次数/小时/ 每个细胞脱嘌呤 580脱嘧啶 29胞嘧啶脱氨 8单链DNA断裂 2300脱嘌呤后单链DNA断裂 580形成O6甲基鸟嘌呤 130皮肤中嘧啶二聚体形成 5104第107页第107页（三）基因人工诱变 体外定向突变 此技术由加拿大学者 Michael Smith 于1985年建立。主要由于基因和蛋白质结构与功效研究。1、体外定向突变办法： 聚核苷酸介导单链模板定点突变； 双引物法定点突变； 用掺入U 单链为模板进行聚核苷酸介导体外定点突变。第108页第108页

38、2、聚核苷酸介导体外定点突变原理： 先合成一条包括定点突变碱基及附近序列 一段寡核苷酸。 将待研究DNA克隆变性后插入到M13中。 将合成寡核苷酸与M13中DNA克隆进 行分子杂交。 以寡核苷酸为引物， M13中DNA克隆 互补单链为模板，合成完整互补链。 将此双链DNA导入大肠杆菌中，经修复和DNA复制即可得到稳定遗传突变DNA克隆。 取得突变体DNA再送回细胞内，检测突变效应： 等位基因代换法；重组DNA技术；DNA同源重组。第109页第109页（四）适应性突变 不能利用乳糖LacZ菌株，放在 以乳糖作为唯一碳源培养基中生 长，便突变产生能够利用乳糖 LacZ菌株，此为适应性突变。第110

39、页第110页 在长期进化过程中，生物体演化出了一整套十分有效DNA损伤修复系统，包括： 纠正偶然复制错误系统复制修复 DNA聚合酶35校读功效 DNA糖苷酶修复系统 错配修复系统等 复制后修复：主要包括 重组修复系统、SOS修复系统。 修复环境原因致DNA损伤系统损伤修复 主要包括：光修复系统、切除修复系统三、DNA损伤修复系统第111页第111页大肠杆菌中DNA修复系统（P52） 错配修复复制修复切除修复损伤修复（碱基切除、核苷酸切除）光修复损伤修复（DNA直接修复）重组修复复制后修复SOS修复复制后修复（造成变异）第112页第112页 DNA复制时碱基多数自发性损伤， 需启 动DNA糖苷酶

40、修复系统。 即在特异DNA糖苷酶作用下，除去损 伤碱基，此时产生了AP部位，又有两种 修复方式。（一）复制修复 1、DNA糖苷酶修复系统：第113页第113页 AP部位可在碱基插入酶作用下，以完整链为模板，按碱基配对原则补回正确碱基。 AP部位也可在AP内切核酸酶作用下，在损伤位点5端切开，然后由53外切酶切除损伤碱基片段，再由 DNA修复聚合酶在缺口处催化DNA合成，最后由DNA连接酶连接缺口，以完毕修复。 AP内切核酸酶，也称为无碱基内切核酸酶。第114页第114页A T C G A G T C GT A G C T C A A CA T C G A G T C GT A G C T C

41、A C糖苷酶A T C G A G T C GT A G C T C A G CA T C G A G T C GT A G C T C A CA T C G A G T C GT A G C T C A G CAP内切核酸酶插入酶A T C G A G T C GT A G C T C A G C脱烷基酶碱基切除修复外切核酸酶、修复聚合酶、连接酶第115页第115页 DNA糖苷酶广泛存在于所有生物体内，对于生物体生存十分主要。假如这类酶基因发生突变，细菌生长情况很差。 DNA糖苷酶依其是否含有AP内切酶活性分两类：第一类：不含有AP内切酶活性，如尿嘧啶糖苷酶、次黄嘌呤糖苷酶、3-甲基腺嘌呤糖

42、苷酶等；第二类：含有AP内切酶活性，如嘧啶二聚体糖苷酶。第116页第116页 尿嘧啶糖苷酶修复系统： 对于纠正复制错误尤为主要。A T C G A G TT A G C U C AA T C G A G TT A G C C AA T C G A G TT A G C C AA T C G A G TT A G C T C A尿嘧啶糖苷酶UAP内切酶连接酶外切酶修复聚合酶dUTP渗入胞嘧啶脱氨第117页第117页 嘧啶二聚体糖苷酶修复系统： 当T4噬菌体感染大肠杆菌细胞时，T4噬菌体基因denV即可表示为嘧啶二聚体糖苷酶，该酶同时含有AP内切核酸酶活性。该酶又称为T4核酸内切酶V，138个aa

43、残基，分子量17KD。嘧啶二聚体糖苷酶辨认嘧啶二聚体部位 5断开糖苷键 形成一个AP位点本身AP内切酶 切开二酯键外切酶切去二聚体聚合酶合成DNA链 连接酶完毕修复第118页第118页2、错配修复系统：原核和真核生物DNA在复制过程中均可产生碱基错配DNA聚合酶35校读功效马上纠正错误(108)错配修复系统第二次纠正错误(10101011)确保DNA复制准确性。第119页第119页 DNA复制保真性：遵循碱基配对规律DNApol对碱基严格选择功效DNApol35即时校读功效错配修复系统第二次纠正错误DNA糖苷酶修复系统第120页第120页 大肠杆菌错配修复系统参与原因： 三种错配修复基因表示产

44、物MutS、MutL 和MutH启动该系统。 GATC内切核酸酶（错配矫正酶）与MutH蛋 白一 起切开单链。 DNA解螺旋酶解螺旋。 双向外切核酸酶依次切除错配核苷酸。 DNApol填补空隙。 DNA连接酶完毕修复。（1）大肠杆菌错配修复系统作用机制第121页第121页 错配修复过程：MutS辨认结合到错配部位，形成MutS-DNA错配复合物启动MutL与错配复合物结合，激活GATC核酸内切酶和MutH蛋白两者对含有错配碱基和GATC序列单链进行内切DNA解螺旋酶(MutH蛋白)解螺旋双向性外切核酸酶依次切除错配核苷酸DNApol以甲基化亲代母链为模板填补空隙DNA连接酶连接切口完毕修复第1

45、22页第122页CH3CH353CH3CH353MutLMutSMutHCH3CH353 解螺旋酶外切核酸酶CH3CH353DNApolDNA连接酶第123页第123页 如何辨认复制后碱基错配子链呢？ 正常情况下，天然DNA复制后腺嘌呤N6位都进行甲基化。 腺嘌呤甲基化是错配修复系统辨认标志。 这一标志含有碱基序列特异性，即N6-甲基腺嘌呤都存在于GATC序列中。 新合成子链在其合成后瞬间GATC序列中腺嘌呤未被甲基化，修复系统就能区别甲基化母链与未被甲基化子链。第124页第124页（2） 真核细胞错配修复系统： 错配修复基因已从酵母和人类克隆出来，其产物功效与大肠杆菌相同，都含有链特异性，但

46、修复能力强于大肠杆菌。大肠杆菌只能修复3个或3个下列错配核苷酸，而人类则可修复5个或5个以上错配袢。细菌 酵母 人类mutS MSH2 hMSH2mutL MLH1 hMLH1 PMS1 hPMS1 hPMS2mutH ? ?错配修复基因第125页第125页3、碱基丢失修复： 碱基丢失可产生AP位点： 一方面利用AP内切酶、53外切酶、聚合酶和连接酶修复作用； 另一方面直接利用插入酶补回正确碱基。关于碱基插入酶生物学意义不十分清楚，它也许为修复AP位点提供了一条更为迅捷途径，当AP内切酶基因突变时，这一途径更为重要。第126页第126页（二）损伤修复1、光修复DNA直接修复 光复活修复是一酶促

47、反应过程，催化该反应 酶称光复活酶。可见光FADH2 蝶呤紫外线光复活酶酶DNA复合物二聚体裂开酶释放第127页第127页UV光修复酶NNOOCH3NNOOCH3RRPNNOOCH3NNCH3OOHHRRP嘧啶二聚体形成与解聚第128页第128页2、切除修复 切除修复是一酶促反应过程，主要包括三步反应： DNA特异内切酶或糖苷酶辨认DNA损伤部位， 并在损伤位点5端切断DNA链，然后在53 外切酶作用下逐步切除损伤DNA片段。 DNA修复聚合酶在缺口处催化DNA合成，使其取 代损伤DNA片段。 在DNA连接酶作用下，使新合成DNA 片段与 原有DNA片段连接，以恢复DNA原有结构。 是生物界普

48、遍存在现象，为哺乳动物DNA损伤 主要修 复方式。第129页第129页 DNA损伤核苷酸切除修复DNA错配修复系统 切除修复碱基切除修复核苷酸切除修复 糖苷酶修复系统复制修复损伤修复 第130页第130页 与紫外线损伤相关基因包括： uvrA、uvrB、uvrC、uvrD 表示产物为： UvrA、UvrB、UvrC、UvrD。 UvrA含有ATP活性，可辨认DNA损伤部位，使DNA构象改变，有助于UvrB与损伤DNA结合。（1）原核生物DNA损伤核苷酸切除修复： 大肠杆菌UvrABC切除修复系统最清楚。第131页第131页UvrAUvrA2UvrA2UvrB2UvrA2UvrB2DNAUvrA

49、2UvrC进入UvrB2UvrC2DNAUvrB在损伤部位3端切口UvrC在损伤部位5端切口(此双切不同时，3在5后)UvrD解旋释出损伤片段UvrCDNApol填充空隙连接酶完毕修复(Leu拉链) 损伤修复过程： 可修复切除12-13个核苷酸片段。 第132页第132页E.coli切除修复方式DNApol,dNTPOH PDNA ligaseATPADPUvrAUvrBUvrCUvrBUvrD第133页第133页 真核生物从酵母到人类，切除修复基因和蛋白质高度保守，十分相同，但修复过程比原核生物复杂得多；人类核苷酸切除修复约需30种基因产物参与。 人类核苷酸切除修复与原核生物相同点： 均是双

50、内切，且不同时。 修复过程均可概括为识：识别损伤部位； 切：切除损伤片段； 补：修复合成DNA； 连：连接切口。（2）真核生物DNA损伤核苷酸切除修复：可修复切除27-29个核苷酸片段。 第134页第134页 切除损伤DNA链 16种蛋白质 3种蛋白质 切除DNA片段大小 2729个 1213个 TFH 和复制蛋白 需要 不需要 DNA连接酶 四种 一个 人类与大肠杆菌切除修复蛋白质无一有序列同源性。 人类核苷酸切除修复与原核生物不同之处人类 原核生物第135页第135页1、重组修复（三）复制后修复 这种修复是指DNA分子损伤范围较大，来不及 修复就进行复制，复制后再进行切除修复，故 称复制后

51、修复。第136页第136页355复制353535353诱导激活RecA蛋白535353535353损伤DNA分子切除修复 DNApolDNA连接酶RecA蛋白脱落 大肠杆菌重组修复机制：第137页第137页 recA基因激活recA基因损伤DNA诱导激活 DNA-RecA蛋白结合物水解LexA蛋白recA基因高浓度mRNA和 RecA蛋白低浓度mRNA和 RecA蛋白LexA 阻遏蛋白被降解LexA蛋白第138页第138页 重组DNA活性； 单链DNA结合活性； 蛋白酶活性，即能水解LexA阻遏蛋白中 丙氨酸残基与甘氨酸残基之间肽键，破 坏其阻遏作用。 一旦重组修复完毕，诱导信号消失， Rec

52、A蛋白不再活化，细胞内LexA阻遏蛋白 重新增长，修复过程即被终止。 RecA蛋白(378kD)是一个多功效酶：第139页第139页2、SOS修复 SOS修复是50年代在大肠杆菌中发觉， 也称错误倾向修复。 与SOS修复相关基因主要是： recA基因和lexA基因。 正常情况下，细胞SOS系统是关闭， 各基因均被LexA阻遏蛋白所封闭而没 有活性，很少产生转录产物。所有SOS 基因操纵子都含有20个bpLexA结 合位点，高度保守，称为SOS框(SOS box)。第140页第140页 当DNA损伤时，recA基因被激活，RecA蛋白 表示增强并与单链DNA结合，激活蛋白酶活性， 水解LexA阻

53、遏蛋白，SOS基因开放，修复酶 及相关蛋白表示，抢救修复损伤DNA。 LexA阻遏蛋白分子量22700，由lexA基因编 码，在正常细胞内非常稳定，控制着许多 操纵子、尤其是各种修复基因表示。 第141页第141页 细菌限制与修饰系统 细菌限制修饰系统构成： 甲基化酶和限制性核酸内切酶 作用：预防外来DNA入侵。 即：限制性核酸内切酶只能切断外来 DNA，不能切割本身，因本身DNA有 甲基化修饰。第142页第142页 真核生物DNA损伤修复特点 1、染色质水平与基因水平研究（1）在修复过程中核小体需进行重组，其5端与3端修复效率高于核小体中心部位。可能因为核小体各部位DNA对核酸酶消化敏感性不同。（2）同一细胞不同基因修复效率不同，转录活性基因优先被修复，且修复效率高于非编码序列。 人类细胞经紫外线损伤后，整个基因组在二十四小时几乎全部被修复。（3）哺乳动物存在修复冷点，指存在非优先修复基因或根本不被修复DNA片段。如rRNA基因，即使在转录活性状态也不优先修复，其修复效率甚至比整个基因组修复效率还低。第143页第143页紫外线照射后哺乳动物细胞DNA损伤修复细胞种类 修复百分数 8小时后 二十四小时后中国仓鼠 基因组DNA 15卵巢细胞 非编码区 15 (CHO) 活性基因 50 75人类细胞 基