二甲卡因,一种合成的可卡因类似物：通过色谱 - 线性

1、二甲卡因，一种合成的可卡因类似物：通过色谱 - 线性离子阱（高分辨率）质谱检测大鼠模型尿中含量研究其体内代谢摘要二甲卡因，可卡因人工合成衍生物，秉着“胜利即正义”，作为一种新的精神活性物质广为使用，然而并没有进行任何安全检测如药物代谢的实例研究。因此这项工作的目的是通过使用液相色谱（高分辨率）质谱（LC-HRMSn）研究其体内和体外代谢。向Wistar大鼠给药二甲卡因（20 mg/kg），在偶联物酶裂解后通过固相萃取或利用蛋白质沉淀法来提取尿中的代谢物。利用LC-HRMS来分离和鉴别代谢产物。主要的相反应是酯水解，脱乙基，芳香环的羟基化反应。主要相反应是的母体化合物中对氨基苯甲酸和几个相反应代

2、谢产物N-的乙酰化。在给予普通剂量后鉴别代谢产物用于大鼠尿中二甲卡因鉴别。通过使用GC-MS和LC-MS的标准尿液筛查，可以检测到二甲卡因和它的代谢产物。关键字：策划药；二甲卡因；代谢产谢；尿液筛查；C-MS；LC-MS；LLC-HRMS前言二甲卡因（DMC，可卡因，3-二乙基氨基-2,2-二甲基丙基）-4-氨基苯甲酸酯）在20世纪30年代用作牙科和眼科的局部麻醉剂，也作为多巴胺再摄取抑制剂， 类似于可卡因具有兴奋作用，因此不能在市场随意流通，因为它有这些精神效应。于此同时DMC吸引了全球药物的关注，是合法可卡因替代品，正如所谓“新的精神活性物质”（NPS）。它甚至名列欧洲毒品和毒品成瘾监测中

3、心 “合成可卡因衍生物”范畴还而在众多的网上商店提供。食用二甲卡因后，消费者有愉悦的感觉，但也呼吸困难和心绞痛的投诉。大鼠腹膜内注射后比较体内二甲卡因和可卡因的药理性质。对多巴胺（DA）水平和它的代谢产物进行了测量。研究表明二甲卡因通过刺激奖赏系统度提高多巴胺在伏隔核的浓度。伍德沃德等，表明DMC在抑制多巴胺再摄取方面效力上类似于可卡因。威尔科克斯等比较不同的局部麻醉药的药理药性，总结不同药物抑制多巴胺摄取效力的顺序为：可卡因 二甲卡因丁卡因普鲁卡因 氯卡因。他们还发现，在另一项研究中，DMC增加 DA的含量，而且比可卡因更有可能被猴子引发自办。代谢和探测生物样本结果尚未公布。因此，这项工作的

4、目的是用液相色谱 - 高分辨线性离子阱质谱（LC-HR MS）鉴别大鼠尿中期和期代谢产物，并通过使用GC-MS和LC-MS标准尿液筛查方法（SUSAS），研究的正常使用者尿中的剂量探测限。实验化学药品和试剂二甲卡因（英国特丁顿，LGC公司），Isolute HCX墨盒（130 mg，3mL）（瑞典，Uppsala）。所有的化学药品和试剂来源VWR（德国，DarRmstadt公司），并且都属于分析用纯度。尿样本在体内代谢的研究是通过使用雄性大鼠（Wistar系，查尔斯河，Sulzfeld，德国）尿液，毒理诊断原因符合德国法律。为鉴别代谢物，胃插管给单一、高（20mg/kg体重）剂量的二甲可因水性

5、悬浮液。将大鼠置于代谢笼24 h，水可自由采食。在24小时内分离粪便收集尿液作为样品池。所有样品直接分析储存在-20。给药前收集空白尿液，检查是否有化合物干扰样品。用于LC-HRMS检测相反应代谢产物的样品制备和Welter等观点一致，用乙酸（1 mol/L，大约50微升）将2.5毫升尿液的PH值调至5.2，50微升的葡萄糖醛酸酶（EC no.3.2.1.31; E.Merck公司，达姆施塔特，德国）和芳基硫酸酯酶（EC3.1.6.1无; E.Merck公司）混合，在56孵育1.5 h。然后用2.5毫升水稀释尿液样本，并上载先前用1 ml甲醇和1ml水调好的HCX盒。样品通过后，盒用1ml水，

6、1ml 0.01mol/L的盐酸，并再次用1mL水冲洗。保留的非基本化合物首先洗脱到装有1ml甲醇（级分1）的1.5毫升反应小瓶中，而第二步骤中基本化合物洗脱在装有1mL 98/2（v/v）的混合物：新制备的甲醇-32氨水（级分2）不同的小瓶。该洗脱物在56氮气流中蒸发至干，重新溶于1:1的10mmol/L水性酸铵缓冲液和含有0.1（v/v）甲酸乙腈混合溶液中。用于LC-HRMS检测相反应代谢产物的样品制备如其他地方所述葡糖苷酸和硫酸盐反应。简言之，向200L尿加入200L乙腈混合，混合物离心14000g,5 min，和取1 0L上清液用于LC- HRMS分析。LC-HRMS鉴别相反应代谢产物

7、按照Welter等所说， 通过由一台脱气机，一四元泵，和UltiMate 3000 RS自动进样器，配备了加热电喷雾离子化（HESI）II源的TF Velos轨道离子阱组成Dionex UltiMate3000 RS泵（赛默飞世 科学（TF），Dreieich，德国）来分析提取物。该LC柱是一个TF的Hypersil Gold（1502.1毫米，1.9微米）。用10mmol/L含有流动相组分A：0.1甲酸铵缓冲液（v/v），流动相B：含0.1甲酸（v/v）乙腈的甲酸铵缓冲液进行程序梯度洗脱。洗脱梯度为A从98至0时间设置为21分钟，流速为500L/min,进样体积为10L。在MS操作条件为：E

8、SI，正模式；套管氮气气流率40 AU；辅助气体为20 AU；源电压4 kV;源加热器温度为400；离子传输毛细管温度为300；毛细管潜在的4 V. CID MS-MS实验在数据依赖扫描模式进行（M / Z 100-800）。其他设置为：标准化碰撞能量35；最小信号阈值100计数;外存储 30000；隔离宽度1.5 U；激活Q值为0.25；激活时间为30毫秒；动态排除模式；重复计数为2；重复持续时间15秒；排除持续时间15秒。该TF校准混合物用于日常质量校正。GC-MS 尿液筛查鼠尿样品制备按照之前公开的方法。简言之，将尿液样品提交至相反应酸水解后的结合物然后用二氯甲烷 - 异丙醇 - 乙酸乙

9、酯混合液1：1：3（V / V）萃取。蒸发后，在微波照射（450瓦，5分钟）下用乙酸酐 - 吡啶混合物乙酰化残余物，蒸发，溶解在100L的甲醇。;通过使用带有HP5972A MSD质量光谱仪和HP MS化学工作站（DOS系列）HP G1034C软件版本C03.00的惠普（安捷伦，德国Waldbronn HP）5890系列II气相色谱仪，分析萃取液。气相色谱条件分别为：不分流进样；Thermo Scientific的TG-1MS毛细管柱（12米0.2毫米 I.D.），交联甲基聚硅氧烷，330纳米的薄膜厚度；注入口温度为280；载气氦气;流速1 mL/min；碰撞气体甲烷。该柱温度2分钟保持在10

10、0， 然后以每分钟30程序升温至310维持5分钟。该MS条件为：全扫描模式下，M /Z 50-550 U；电子电离（EI）模式下，电离能为70 eV；离子源温度为220；毛细管直接跨面，在280下加热。质量色谱仪峰的鉴别是由电脑比较峰下质量光谱（背景扣除后）确定的。此外，由GC-MS系统获得的全扫描的数据文件通过自动化质量光谱反卷积和鉴定系统（AMDIS）进行了评价。LC-MS 尿液筛查尿液样品（100L）用乙腈稀释，摇匀，离心，蒸发，重新溶解在溶剂中。通过使配备了一个HESI二极源的TF LXQ线性离子阱质谱，并连接到TF的Accela液相色谱系统来分析样品。该LC条件适用于LC-HRMS，

11、MS设置如别处描述。简言之，数据依赖型串联质谱法（DDA）是从MS1选择母离子； 一次裂解进行全扫描模式（M/Z 100-800）。 二次裂解和三次裂解在DDA模式进行：选4个DDA MS2扫描过滤器，在一次裂解中四个最强烈的信号中提供二次裂解；另外，选择8个三次裂解扫描过滤器来记录MS2最强烈和第二最强烈的信号。结果和讨论LC-HRMS分析的二甲卡因的相和相代谢物LC分离鼠尿提取物之后用全扫描HRMS鉴定二甲卡因的尿代谢物。代谢产物结构通过不同的MS阶段检测到的碎片来推测，这是碎片与母体化合物相关。LC- HR MS能在精确质量的基础上彻底鉴别代谢产物。根据 HRMS光谱图所示(Fig.1)

12、 ，I相代谢产物被鉴定为：2-（二乙基氨基）-2-甲基丙醇（光谱图2），去乙基，羟基，羟乙基，二羟基，和羟基二去乙基 DMC。根据在图中所示的HRMS谱（Fig.2）Fig.1 二甲卡因相反应代谢产物的LC-HRMS的光谱，它们PM的精确质量记录在MS1，在相应的主要碎片记录在MS2，和MS2的两个最高峰的碎片记录在MS3，如果有的话，元素组成的计算也给出精确质量的精确质量的偏差，以ppm错误给出。 Fig.2 二甲卡因相反应代谢产物的LC-HRMS的光谱，它们PM的精确质量记录在MS1，在相应的主要碎片记录在MS2，和MS2的两个最高峰的碎片记录在MS3，如果有的话，元素组成的计算也给出精确

13、质量的精确质量的偏差，以ppm错误给出。我们确定为下列另外的化合物是以N-乙酰基代谢物，葡糖苷酸，或两者的组合形式排泄：N-乙酰，羟基N-乙酰，去乙基，N-乙酰，二去乙基 N-乙酰，羟去乙基 N-乙酰，羟基 - 双 去乙基， N-乙酰，N-O葡糖苷酸，羟基去乙基-N-O葡糖苷酸，羟基葡糖苷酸，二 - 羟基葡糖苷酸，2-（二乙氨基）-2-甲基丙醇葡糖苷酸，羟去乙基葡糖苷酸，羟基 - 双 去乙基葡糖苷酸和羟基N-乙酰葡糖苷酸二甲卡因。（括号中的数字是图1和图2中对应的质谱的数目）。表1列出了计算和测量的质量以及以ppm计量的所有相相反应的数值。 ESI-HRMS测量的相相反应代谢产物的鉴别及相应的

14、碎片二甲卡因的质子化分子碎片（M/Z 279.2071，频谱1）旁有一些特征的碎片。旁酯键旁的裂解产生有m/z 120.0446（对氨基苯甲酸）碎片离子以及从侧链脱水产生有m /z142.1593的碎片离子。另一种裂解方式是侧链胺的裂解，产生m/ z 206.1181（二乙基氨基的断裂）碎片离子。二次质谱裂解中最丰富的离子（m/z 142.1593）在第三次质谱裂解阶段进一步裂解为m/z 86.0964碎片离子。在这些碎片离子谱图的基础上，考虑到代谢反应和不同元素组成引起质量改变，通过比较不同阶段的质谱谱图来鉴别二甲卡因的代谢产物。叔胺的脱乙基化会产生m/z 251.1754代谢产物。侧链碎片

15、离子m/z值改变了28u（在二次裂解中m/z由142.1593变为114.1279；在三次裂解m/z值由86.0964变为58.0650）表明去乙基化。如光谱图8所示芳香环系统的羟基化产生了一次裂解碎片分子（m/z 295.2015）并使得对氨基苯甲酸部分相应的二次裂解碎片离子改变了16 u（m/z由120.0446变为136.0395，m/z 206.1181变为222.1129）。光谱图5和7化合物分别代表芳香环去乙基和羟基化后的两种异构体。光谱图4和6化合物分别代表芳香环双去乙基化和羟基化后的两种异构体。对于相反应代谢物，N-乙酰基化是最主要的反应。乙酰基化的二甲卡因的质子化分子碎片（m

16、/z 32。2177，光谱图24）产生几个特征性碎片。酯键旁的裂解导致乙酰化的对氨基苯甲酸部分碎片峰为m/z 162.0552（由m/z 120.0446改变了42 u）。数值的变化也出现在光谱图19和21中。侧链的位断裂会产生m/z 142.0446的碎片离子峰和相应的m/z 180.0659碎片离子。在这些光谱图的基础上，考虑到物质不用元素组成和质量的不同，二甲卡因的乙酰化代谢产物通过比较不同阶段裂解的质谱图来鉴别。例如，一个羟基化的芳香环乙酰化后会引起碎片离子由m/z 136.03965到m/z 178.0502的改变（17，18，20，22和23）。二甲可因的相反应进一步的反应代谢产物

17、是葡萄糖醛酸苷化物。所有的羟基化代谢产物都以葡萄糖醛酸形式排泄的，质子化分子离子 m/z 176.0321的质量改变以及通过比较相反应代谢产物质谱图各自二次裂解峰可以证明。此外二葡萄糖醛酸苷（葡萄糖醛酸苷羟胺）先前描述的其他化合物是人类相关的可检测的。除了乙酰化或葡萄苷酸化，另外一种相反应在乙酰化和葡萄苷酸化后排泄被检测到。建议的代谢途径在之前所述的代谢物基础上，代谢途径如图所示。代谢途径包括酯的裂解，去乙基化，双去乙基化，芳香羟基化，羟基化以及这些组合反应。相反应产物包括乙酰化和葡萄苷酸化及两者组合反应。为了与二甲卡因比较，选择的结构相关的普鲁卡因主要被酶裂解为乙酰化的对氨基苯甲酸和，二乙基己醇胺。 或的二甲卡因毒理检测正如别处所述，利用尿液筛查法，在给药mg/kg后 ，二甲卡因和几个它的代谢产物可以再大鼠尿液中检测到。因此，通过固定药物和代谢产物的光谱图和保