黑曲霉脂肪酶tabI酶学性质及乳酸乙酯合成能力的研究

1、PAGE 11 -黑曲霉脂肪酶tabI酶学性质及乳酸乙酯合成能力的研究酯类物质是中国白酒最主要的风味物质，其含量占风味物质总量的40%65%，其中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯占总酯含量的90%以上，被称为形成白酒主要风味的四大酯1。与其他大多数酯类不同，乳酸乙酯结构中的羟基使其既能溶于乙醇又具有较好的亲水特性，在白酒中起到增加醇厚感、协调香味和压水味的作用2。在白酒十二大香型中，乳酸乙酯是米香型、豉香型、老白干香型白酒中最重要的酯类物质。郑岩3以桂林三花为对象研究了米香型白酒的指纹图谱，结果表明其组成成分简单，所含组分91%以上相似，相对峰面积最大的是异丙醇，其次是乳酸乙酯。杨帅等4

2、对清雅型“玉冰烧”白酒酒体风格特征进行了剖析，结果表明清雅型“玉冰烧”白酒整体酯类比较单一，以乙酸乙酯和乳酸乙酯为主，且乳酸乙酯和乙酸乙酯的比值(1.3)独特。霍丽娜等5运用气相色谱技术分析了老白干原酒的微量成分，结果表明老白干酒的主要酯类物质是乳酸乙酯和乙酸乙酯，且原酒中的乳酸乙酯含量高于乙酸乙酯，乳酸乙酯在总酯中所占比例比其他香型都要高。在白酒生产过程中，酯类物质的合成主要包括微生物代谢生成、有机化学反应生成和生物酶催化合成3种途径6。王月梅等7研究表明清香型酒中乙酸乙酯主要是由大量的生命活动旺盛的生香酵母及产酯霉菌等微生物的代谢生成。张浩等8研究表明，在浓香型大曲中己酸乙酯的合成主要以酯

3、化酶催化作用为主，而丁酸乙酯和乳酸乙酯的合成以化学作用为主。吕云怀等9对酱香大曲、浓香大曲和清香大曲中的风味物质与其产品风格特征的关系进行了分析，结果表明其只在清香型大曲中检测到了乳酸乙酯。在以往酯类物质合成的研究中，多是围绕己酸乙酯和乙酸乙酯进行的，刘雪等10将华根霉麸曲作为粗酶制剂，催化己酸与乙醇发生酯化反应，使酒体中己酸乙酯的含量达2302mg/100mL；潘志友等11通过将南极假丝酵母脂肪酶B展示于酿酒酵母细胞表面，并将该重组酿酒酵母菌体冻干粉作为全细胞催化剂在非水相中催化合成了己酸乙酯，使其产率达98%；葛清秀等12研究了碱性脂肪酶在正庚烷中催化合成乙酸乙酯，转化率可达71.4%。如

4、前所述，老白干香型白酒中乳酸乙酯的含量相对较高，因此本研究拟从老白干香型大曲中分离酯化酶活力较高的黑曲霉菌株，并进行转录组分析，从黑曲霉菌株中克隆基因转录水平较高的脂肪酶基因tabI。然后使其在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，并进行酶学性质和合成乳酸乙酯能力的解析，为乳酸乙酯脂肪酶的开发和应用奠定基础。1材料与方法1.1菌种黑曲霉(Aspergillusniger)、大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5和BL21(DE3)及质粒pET28a(+)，均为本实验室保藏。1.2主要试剂限制性内切酶、LATaqDNA聚合酶，大连宝生物工程有限公司；同源重组酶，南京诺唯赞生物科技股份有

5、限公司；质粒小量提取试剂盒、小量DNA产物纯化回收试剂盒、异丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-d-thiogalactoside，IPTG)、卡那霉素、BCA蛋白浓度测定试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；Ni柱、PD-10脱盐柱，GE公司；C2C16系列对硝基苯酚羧酸酯、其他生化试剂,均为分析纯，天津市江天化工技术有限公司。1.3酯化酶活力的测定对从老白干香型大曲中分离出来的菌株，进行酯化酶活力的测定，具体方法参考文献13。1.4黑曲霉脂肪酶基因的克隆与表达1.4.1基因克隆与重组菌株的构建将从老白干香型大曲中分离出的高酶活力菌株送至北京诺禾致源科技有限公司做转录组分析，筛选出基因解释

6、为脂肪酶且基因转录水平较高的基因。在NCBI上与A.nigerCBS513.88相对比，获得基因转录水平较高基因的开放式阅读框(openreadingframes，ORF)，并送至金唯智生物科技有限公司进行基因合成及密码子优化。将合成后的片段利用PCR技术从载体pUC57上扩增下来并连接至质粒pET28a(+)，将重组质粒转化至E.coliDH5稳定后，再转化至E.coliBL21(DE3)进行诱导表达。1.4.2脂肪酶tabI的制备将验证成功的重组菌株加入IPTG在20下诱导20h后，离心收集菌体，并用pH7.4的PBS缓冲液重悬菌体。菌体经过超声破碎后，离心获得含His-tag的融合蛋白上

7、清液。含His-tag的融合蛋白经过Ni柱进行洗脱，洗脱下来的重组蛋白用PD-10脱盐柱进行脱盐，冷冻干燥备用。蛋白质浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。1.5脂肪酶tabI酶活力的测定与底物特异性分析脂肪酶酶活力的测定方法参照文献方法14-15，并做改进。500L的反应体系：400L、20mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液、50L、5mmol/L的pNPA和50L酶液。30下反应1min后，在410nm下测定吸光度值。脂肪酶活力定义为在一定pH和温度下，1min催化对硝基苯酚羧酸酯水解生成1mol对硝基苯酚的酶量为1个酶活力单位15-17。按照上述方法，分别以7种不同碳链长度(C2

8、C16)的对硝基苯酚羧酸酯为底物，测定脂肪酶tabI酶活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活力15。1.6脂肪酶tabI动力学参数的测定脂肪酶动力学参数根据Lineweaver-Burk双倒数作图法测定。以对硝基苯酚羧酸酯为底物，用无水乙醇配制一系列不同浓度的底物，按照1.5的方法测定不同底物浓度下的脂肪酶tabI酶活力。以底物浓度的倒数1/S为横坐标，反应速率的倒数1/V为纵坐标作图，并根据公式(1)计算得出Km和Vmax16-19。(1)1.7脂肪酶tabI酶学特性分析按照1.5的方法，对脂肪酶tabI进行酶学特性分析，以最高酶活力为100%计算相对酶活力。(1)温度对脂肪酶tabI酶活

9、力的影响：测定2075的酶活力，每隔5为检测点。(2)pH对脂肪酶tabI酶活力的影响：测定pH4.510的酶活力，pH4.55.5时缓冲液为20mmol/L乙酸铵缓冲溶液，pH6.07.5时缓冲液为20mmol/L磷酸盐缓冲溶液，pH8.09.0时缓冲液为20mmol/LTris-HCl缓冲溶液，pH9.5、10.0时缓冲液为20mmol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液15-17。(3)温度稳定性：将酶液分别在20、30、40、50、60放置04h后，在最适作用条件下测定残余酶活力。(4)pH稳定性：将酶液分别在pH为6、7、8、9、10环境下放置04h后，在最适作用条件下测定残余酶活力。(5)

10、金属离子或螯合剂对脂肪酶tabI酶活力的影响：将40L酶液与不同的10L、1mmol/L的金属离子或螯合剂混合，室温下放置2h后，在最适作用条件下测定残余酶活力16-17。(6)有机溶剂对脂肪酶tabI酶活力的影响：将40L的酶液与10L不同的有机溶剂混合，室温下、150r/min振荡2h后，在最适作用条件下测定残余酶活力16-17。1.8脂肪酶tabI合成乳酸乙酯条件优化参照文献14,20，以叔丁醇为溶剂，配制不同浓度的乙醇和乳酸溶液，加入一定量的脂肪酶tabI，在40、150r/min下反应12h，用气相色谱法测定乳酸乙酯的含量，对照组加入相同量的高温灭活酶粉。气相色谱检测条件为：检测器为

11、FID，色谱柱为HP-INNOWAX(30m0.320mm0.25m)，高纯度氮气载气流速设置为0.8mL/min，进样口温度200，检测器温度210，进样量为1L，分流比为101。起始色谱柱温度为50并维持8min，然后按照5/min的速度提升到180，维持10min21-22。按照上述方法，优化脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的反应条件。结果以实验组减去对照组的合成量表示。(1)最佳乙醇浓度的确定：在反应体系中，乳酸浓度保持在1.17mol/L，乙醇浓度分别为8.190、8.775、9.360、9.945、10.530、11.115mol/L，测定乳酸乙酯合成量。(2)最佳乳酸浓度的确定：在反应

12、体系中，乙醇浓度按照上述实验获得的最佳乙醇浓度保持恒定，乳酸浓度分别为0.936、1.170、1.775、2.106、2.340、2.925mol/L，测定乳酸乙酯合成量。(3)最佳反应时间的确定：在反应体系中，乙醇和乳酸浓度按照上述实验获得的最佳浓度保持恒定，分别在反应时间为214h时取样检测乳酸乙酯的合成量，每隔2h为1个检测点，测定乳酸乙酯的合成量。2结果与分析2.1酯化酶活力测定对从老白干大曲中分离出的菌株，进行了酯化酶活力的测定，结果见表1，在黑曲霉、黄曲霉、根霉、青霉、红曲霉中，黑曲霉H7的酯化酶活力是最高的，为1706.60U/g，所以选取黑曲霉菌株H7送至诺禾致源公司做转录组分

13、析。表1菌株酯化酶活力的测定结果Table1Theresultsofthedeterminationofthestrainsesterificationenzymeactivity2.2基因克隆与蛋白的表达通过转录组分析获得了9个基因转录水平较高的脂肪酶基因，按照1.4.1的方法进行重组质粒的构建，成功构建出了重组质粒，并将这些重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，其中只有一个是可溶性表达，其余8个均为包涵体，将可溶性表达的脂肪酶基因与A.nigerCBS513.88相对比，该基因在基因组CBS513.88中基因序号为An12g04640，命名为tabI。重组质粒Pet28a(+)-

14、tabI构建流程如图1所示，经过质粒酶切验证带条大小与目的片段一致，如图2所示。图1重组载体pET28a(+)-tabI构建流程图Fig.1TheconstructionflowchartoftherecombinantvectorpET28a(+)-tabIM-10000marker.1-带同源臂目的基因825bp；2-重组质粒EcoR单酶切验证(从上至下条带大小分别为5375bp和783bp)图2目的基因和重组质粒验证图谱Fig.2Thetargetgeneandrecombinantplasmidverificationmap2.3脂肪酶tabI的制备重组菌株BL21-tabI经过IPT

15、G诱导表达后的上清液用不同浓度的咪唑洗脱，洗脱液进行SDS，结果如图3所示。在100mmol/L浓度的咪唑处，出现较浓的单一条带。脂肪酶tabI的分子质量约为29kDa，与预测的蛋白分子质量一致。图中重组蛋白tabI破碎后的沉淀中出现了3条较浓条带，其中上面2条为空质粒pET28a(+)的蛋白条带，第3条蛋白条带有两部分来源，一是空质粒pET28a(+)的蛋白条带，二是沉淀中没有溶解部分脂肪酶tabI的蛋白条带。因此，后续脂肪酶tabI均可以用100mmol/L浓度的咪唑洗脱，洗脱液用PD-10脱盐柱进行脱盐后，冷冻干燥备用。脱盐后的脂肪酶tabI比酶活力为54.34U/mg。M-蛋白分子质量

16、标准；1-空pET28a(+)破碎后的上清液；2-空pET28a(+)破碎后的沉淀；3-重组蛋白tabI破碎后的上清液；4-重组蛋白tabI破碎后的沉淀；5-用10mmol/L咪唑洗脱的重组蛋白tabI；6-用100mmol/L咪唑洗脱的重组蛋白tabI图3脂肪酶tabI的SDS图谱Fig.3TheSDSelectrophoresispatternoflipasetabI2.4脂肪酶tabI底物特异性分析及动力学参数测定按照1.5的方法，进行脂肪酶tabI底物特异性分析，结果如图4所示，脂肪酶tabI偏好于水解短链对硝基苯酚羧酸酯，对中长链对硝基苯酚羧酸酯基本没有水解作用，其最适作用底物为对硝

17、基苯酚乙酸酯。按照1.6的方法，以不同浓度的对硝基苯酚乙酸酯为底物，在40、pH8下测定脂肪酶酶活力，采用双倒数作图法，绘制脂肪酶tabI的酶动力学曲线，可得脂肪酶tabI的Km值为0.85mmol/L，Vmax值为63.75mmol/(mLh)。图4脂肪酶tabI的底物特异性Fig.4ThesubstratespecificityoflipasetabI2.5脂肪酶tabI酶学特性分析2.5.1脂肪酶tabI最适温度和最适pH按照1.7的方法，测定脂肪酶tabI的最适作用温度和最适作用pH，结果如图5所示。由图5-a可知，脂肪酶tabI的酶活力随着温度的升高呈现先升高再降低的趋势。在40时，

18、脂肪酶tabI的酶活力最高，表明脂肪酶tabI的最适作用温度为40，且在4055，脂肪酶tabI的酶活力均保持在60%以上。由图5-b可知，脂肪酶tabI的酶活力随着pH的升高而升高，在pH=8时脂肪酶tabI的酶活力最高，之后脂肪酶tabI的酶活力随着pH的升高而降低，在pH为79时tabI的酶活力保持在60%以上。a-最适温度；b-最适pH图5脂肪酶tabI的最适温度和最适pHFig.5TheoptimumtemperatureandoptimumpHoflipasetabI2.5.2脂肪酶tabI的热稳定性和pH稳定性按照1.7的方法，测定脂肪酶tabI的热稳定性和pH稳定性，结果如图6

19、所示。由图6-a可知，在30和40时，脂肪酶tabI最稳定，在4h内残余酶活力均在80%以上，随着温度的升高，酶活力下降速率明显上升，在20时，脂肪酶tabI在3h内的残余酶活力保持在80%以上，在50和60时，脂肪酶tabI在3h内的残余酶活力保持在60%以上。由图6-b可知，在pH7、8、9时，脂肪酶tabI最稳定，在4h内的残余酶活力均在80%以上。在pH6和pH10时，脂肪酶tabI的稳定性下降。a-热稳定性；b-pH稳定性图6脂肪酶tabI的热稳定性和pH稳定性Fig.6ThethermalstabilityandpHstabilityofthelipasetabI2.5.3金属离子

20、及螯合剂对脂肪酶tabI活力的影响表2为金属离子及螯合剂对脂肪酶酶活力的影响，Zn2+对脂肪酶tabI的酶活力有明显的促进作用，酶活力提高了55.02%；其他金属离子和螯合剂EDTA都对酶活力表现为抑制作用，其中K+、Co2+和Fe3+的抑制作用较明显。表2金属离子及螯合剂EDTA对脂肪酶tabI酶活力的影响Table2TheeffectofmetalionsandchelatingagentEDTAontheactivityoflipasetabI2.5.4有机溶剂对脂肪酶tabI酶活力的影响按照1.7的方法，测定有机溶剂对脂肪酶tabI酶活力的影响，结果如图7所示。叔丁醇和乙醇对脂肪酶ta

21、bI的酶活力表现出了明显的促进作用，二甲基亚砜、氯仿和正己烷对脂肪酶tabI的酶活力基本没有影响，丙三醇、二氯甲烷、苯、十二烷和乙醚对脂肪酶tabI的酶活力有一定的抑制作用，其中苯的抑制作用最明显。图7有机溶剂对脂肪酶tabI酶活力的影响Fig.7TheeffectoforganicsolventsontheactivityoflipasetabI2.6脂肪酶tabI合成乳酸乙酯条件的优化按照1.8的方法，优化脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的条件，结果如图8、表3所示。乙醇和乳酸是合成乳酸乙酯的前体物质。由图8-a可知，随着乙醇浓度的升高，乳酸乙酯的合成量先升高后降低，当乙醇浓度为8.775mol

22、/L时，乳酸乙酯的合成量达到最高值，为33.965mg/L。在达到最高值后，随着乙醇浓度的升高，乳酸乙酯的合成量反而减少。可能的原因是当乙醇浓度过高时对脂肪酶tabI的酶活力有抑制作用，使乳酸乙酯的合成量下降。a-最佳乙醇浓度；b-最佳反应时间图8脂肪酶tabI合成乳酸乙酯的最佳乙醇浓度和最佳反应时间Fig.8ThebestethanolconcentrationandbestreactiontimeforthesynthesisofethyllactatebylipasetabI如表3所示，随着乳酸浓度的升高，反应体系pH降低，乳酸乙酯的合成量呈现先升高后降低的趋势，当乳酸浓度为2.34mol/L时，乳酸乙酯的合成量最高，为208.49mg/L。当乳酸的浓度继续升高时，反应体系的pH越来越低，对酶的构象产生影响，脂肪酶tabI活力下降，乳酸乙酯合成量减少。表3脂肪酶ta