医学微生物学：第四章细菌耐药性检测

1、第四章细菌耐药性检测2022/9/21 目的要求 了解：细菌耐药性检查的几种方法，(抗分枝杆菌药物敏感性试验、厌氧菌体外抑菌试验、抗真菌药物敏感性试验有关章节讲述)。熟悉：临床常用抗菌药物、细菌的耐药性和产生机制。掌握：抗菌药物敏感性试验的意义、抗生素选择原则；KB法和琼脂稀释法检测方法、原理及结果判断；以及常见的耐药细菌检测的意义2022/9/22相关资料细菌：对多种抗生素出现抗药性，已成为影响中国与世界 重症监护患者预后及整体医疗资源的重大威胁在人群层面、医院层面与个体层面上，感染及抗生素滥用 相关控制措施的不足，与抗生素抗药性发生风险上升存在 极强的相关性医学界开始呼吁医师避免不当使用抗

2、生素,方法有二： 一、抗生素疗法仅用于确实罹患细菌感染的患者身上 二、针对需要使用抗生素的患者缩短治疗时间Emerg Infect Dis 2004Infection 2009The Lancet infectious diseases 2001怀疑可能感染时确认感染部位致病性微生物是什么确认需采集的标本类型、检测项目怎样正确采集样本选择标本检测的收集的相应容器适当的培养环境、培养基、鉴定仪器抗菌谱、给药方案、时间等 抗菌药物临床应用基本原则检测前质量控制检测中质量控制检测后结果分析、应用目前可列为微生物标本送检率项目1.无菌体液细菌、真菌涂片； 2.各类合格标本细菌、真菌培养+药敏：血液、骨

3、髓、胸、腹水等 3.肺炎链球菌尿抗原； 4.军团菌抗原/抗体检验； 5.血清真菌G实验或GM试验； 6.血清降钙素原检验（PCT）等 A感染病毒细菌真菌寄生虫非典型病原微生物2022/9/26香港玛丽医院案例海报？Admin World Sepsis Day 治疗脓毒症 | 中国病理生理学会危重病医学专业委员会重症监护情境下-PCT决策流程怀疑脓毒血症-PCT决策流程0.250.25 - 0.50.5 - 1.01若强烈怀疑为脓毒血症，立即展开经验性抗生素治疗；若经临床评估后并未怀疑为脓毒血症，则考虑其他诊断建议给予抗生素强烈建议给予抗生素若临床上怀疑为感染，建议施行经验性治疗建议反复进行临床

4、评估重复检测PCT（6-24小时后）建议反复进行临床评估重复检测PCT（1-2天一次）90%0.25 - 80%0.5 且 PCT下降幅度 1.0 且 PCT浓度上升强烈建议停用抗生素（若临床上已改善）建议停用抗生素（若临床上已改善）建议继续给予抗生素强烈建议继续给予抗生素若病患的临床状况不稳定，应继续给予抗生素建议反复进行临床评估重复检测PCT（1-2天一次）建议反复进行临床评估重复检测PCT（1-2天一次），并考虑停用抗生素的可行性若PCT持续偏高，可能代表治疗失败从2004年起，我国出台了抗菌药物临床应用指导原则。10年过去了，尽管多次下发通知，指导效果并不明显。相反，超级细菌、耐多药菌

5、不断出现。资料显示，全国抗生素人均年消费量138克左右，而美国仅13克。我国住院患者中，抗生素的使用率高达70%，其中外科患者比例高达97%。2022/9/29央视曝自来水检出抗生素 珠江广州段超标严重2022/9/210内容如何选择抗生素如何检测结果解释检测意义2022/9/211一、临床常用抗菌药物2022/9/2122022/9/2132022/9/214其他氨基糖苷类:庆大、AMK、奈替、妥布、链、卡那。对G-杆菌活性强。大观霉素和丙大观对淋菌敏感，解脲脲原体作用好，布鲁菌喹诺酮类：奈啶酸，环丙、加替、吉米、格帕、左氧、氧氟、洛美、莫西、氧氟、司帕、曲发大环内脂类：红、乙酰螺旋：嗜血杆

6、菌、奈瑟菌、支原体、衣原体、军团菌四环素：衣原体、立克次体首选，布鲁菌甘酰胺四环素类Tigecycline/Tygacil（替加环素）：MRSA、肠杆菌科、不动杆菌等氯霉素、林可霉素类糖肽类：万古、替考拉宁 MRSA，脂肽类：多黏菌素B和E 磺胺类及增效剂：其他合成抗菌药：如恶唑烷烔类的合成抗生素：利奈唑胺2022/9/215抗生素列表里新增两种头孢烯亚类药物打破了MRSA (and MR CoNS)耐所有-内酰胺类药物的规则Ceftaroline and Ceftobiprole具有抑制MRSA的活性*未经 FDA 认可 January 2010 CLSI M100-S20. pp 144.

7、 种类 亚类药物名称头孢烯（Cephems）抑制MRSA活性的头孢菌素类CeftarolineCeftobiprole头孢比普酯2022/9/216 Ceftaroline (1) Broad-spectrum cephalosporin (with anti-MRSA activity)广谱头孢菌素类药物（抗MRSA活性） IV only FDA clinical indicationsAcute bacterial skin and skin structure infections(ABSSSIs)急性细菌性皮肤和皮肤结构的感染Community-acquired bacterial p

8、neumonia (CABP社区性肺炎) E. coli， Klebsiella pneumoniae，Klebsiella oxytocaBactericidal against MRSA due to its affinity for PBP2a and against penicillin-nonsusceptibleStreptococcus pneumoniae due to its affinity for PBP2x2022/9/217CLSIM100-S23 2013年Ceftaroline (2)Not active against ESBL, ampC (class C),

9、 orcarbapenemase (e.g., KPC) producing Enterobacteriaceae No significant activity against Pseudomonasaeruginosa Some activity against anaerobes (notBacteroides fragilis 脆弱拟杆菌Group)2022/9/218CLSIM100-S23 2013年第二节：抗菌药物敏感性试验一、意义：1、可预测抗菌治疗的效果2、指导临床医生选择使用抗生素3、提供所选择药物的依据4、监测耐药性2022/9/219二、试验常规抗菌药物选择 选择抗生素

10、A：常规首选：B：临床使用的主要抗生素，尤其在医院感染时使用的抗生素：对A组同类抗生素耐药，对标本来源不同时三代头孢对CSF中肠杆菌；多种微生物感染；多部位感染；感染流行控制；C：对A组耐药的流行株或对A组过敏和不常见的细菌U：仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常见药敏试验：呋喃妥因、四环素、SXT、左氧2022/9/2202022/9/221预报用药(一) 测试药菌名 测其他药物的敏感性 苯唑西林葡萄球菌所有-内酰胺类 四环素 所有（除葡 多西环素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌红霉素G球菌 罗红霉素，克拉霉素， 阿奇霉素克林霉素所有林可霉素2022/9/222预报用药(二)测试药菌

11、名推测其他药物的敏感性氨苄西林肠球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林 替卡西林头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类万古霉素所有替考拉宁2014年CLSI常规药敏试验和报告抗菌药物的建议分组 CLSIM100-S24仅用于MIC法，纸片扩散法不可靠2022/9/223葡萄球菌属 CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告C组补充试验 选择性报告U组补充试验 仅用于泌尿道）阿奇霉素 或克拉霉素 或 红霉素ceftaroline达托霉素氯霉素洛美沙星诺氟沙星克林霉素利奈唑胺环丙沙星 或 左氧沙星 或 氧氟沙星莫西

12、沙星苯唑西林头孢西丁泰利霉素 X2013年青霉素多西环素米诺环素四环素庆大霉素呋喃妥因甲氧苄啶/磺胺甲恶唑万古霉素奎奴普汀/达福普汀 x2013年磺胺甲恶唑利福平甲氧苄啶肠球菌属 CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告C组补充试验 选择性报告U组补充试验 仅用于泌尿道）氨苄西林青霉素达托霉素庆大霉素（仅用于筛选高水平耐药株）环丙沙星左氧氟沙星诺氟沙星利奈唑胺链霉素（仅用于筛选高水平耐药株）万古霉素呋喃妥因四环素2022/9/225-溶血链球菌CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告C组补充试验 选择性

13、报告克林霉素红霉素头孢吡肟 或 头孢噻肟 或 头孢曲松ceftaroline氯霉素达托霉素左氧氟沙星氧氟沙星青霉素 或 氨苄西林万古霉素利奈唑胺奎奴普丁/达福普丁2022/9/226淋病奈瑟氏菌CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告C组补充试验 选择性报告 头孢曲松 头孢克肟大观霉素环丙沙星四环素2022/9/227肠杆菌科 CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告C组补充试验 选择性报告U组补充试验 仅用于泌尿道） 氨苄西林阿米卡星氨曲南头孢噻吩 头孢唑啉阿莫西林/克拉维酸氨苄西林/舒巴坦哌拉西林/

14、他唑巴坦替卡西林/克拉维酸头孢他啶ceftaroline洛美沙星 或氧氟沙星诺氟沙星庆大霉素妥布霉素头孢呋辛氯霉素头孢吡肟四环素头孢替坦头孢西丁呋喃妥因头孢噻肟 或头孢曲松磺胺甲恶唑环丙沙星左氧氟沙星甲氧苄啶多利培南 厄他培南亚胺培南美罗培南哌拉西林甲氧苄啶/磺胺甲恶唑2022/9/228不动杆菌属 CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告C组补充试验 选择性报告U组补充试验 仅用于泌尿道）氨苄西林/舒巴坦阿米卡星头孢他啶哌拉西林/他唑巴坦替卡西林/克拉维酸环丙沙星左氧氟沙星头孢吡肟多利培南亚胺培南美罗培南头孢噻肟头孢曲松庆大霉素妥布霉素多西环素四

15、环素米诺环素哌拉西林甲氧苄啶/磺胺甲恶唑2022/9/229洋葱伯克霍尔德菌 嗜麦芽窄食单胞菌 CLSIM100-S24 2014年A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告甲氧苄啶/磺胺甲恶唑头孢他啶 氯霉素左氧氟沙星美罗培南米诺环素替卡西林/克拉维酸A组首选试验 并常规报告 B组首选试验 选择性报告甲氧苄啶/磺胺甲恶唑头孢他啶氯霉素左氧氟沙星米诺环素替卡西林/克拉维酸2022/9/230第二节、抗菌药物敏感试验 方法抑菌试验杀菌试验体外联合药物敏感试验检测细菌耐药性的其它方法2022/9/231抑菌试验： 用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长的效力纸片扩散法定量测定的稀释法：肉汤稀释法

16、、琼脂稀释法微量稀释法:E试验法：2022/9/232纸片扩散法原理：含有定量药物纸片贴在已接种一定浓度测试菌的琼脂平板上，纸片中所含药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测定药物的敏感程度2022/9/233药敏检测方法1纸片法1、将分纯的菌种调节成一定的浓度0.5m，108cfu/ml2、均匀涂抹在MH平板或其它相应的培养基，并贴上相应的药敏纸片3、35。C，24-48小时后测量抑菌圈直径，用CLSI标准判断S、R、I2022/9/234纸片距平板内缘15纸片中心相距24纸片扩散法操作：贴抗生素纸片202

17、2/9/235纸片扩散法琼脂平板的选择： MH培养基（溶血或非溶血性链球菌加5%血，葡萄球菌苯唑西林耐药检测要求35。C，24小时，2%氯化钠w/v） 厚度4mm，营养要求，pH：在室温（25。C）下，其PH值为7.27.42022/9/236临床分离株及质控株的纸片扩散法试验条件2022/9/237纸片扩散法注意事项：培养基选择抗生素纸片的制备及保存的质量保证适用范围细菌浓度的调节2022/9/238纸片扩散法抗菌药物纸片纸片直径：6.35mm纸重量：吸水重量1：2.53.0，吸水量20ul每片药量：按CLSI标准不同的药物含量不同密封保存：2-8度或负20无霜冷冻保存，使用前室温平衡1-2

18、小时，避免凝集水2022/9/239 中山大学附一院药敏质控记录ATCC25922大肠杆菌抗生素允许范围12/819/8氨苄西啉1016-221718氨苄西啉舒巴坦10/10，19-242222头孢呋辛3020-262524头孢他啶3025-323029头孢曲松3029-353030阿米卡星3019-2625262022/9/240纸片扩散法扩散法药敏试验适用菌种的范围快速生长的兼性厌氧或需氧菌2022/9/241药敏检测方法2、稀释法配制不同浓度的药物肉汤或琼脂平板，接种定量的细菌，孵育24小时后，读取抑制细菌生长的药物稀释度为终点浓度，MIC(ug/ml)。肉汤稀释法:用肉汤培养基者为肉汤

19、稀释法琼脂稀释法:稀释法中用琼脂培养基者2022/9/242肉汤稀释法5121286432416821.5.25.1252022/9/243琼脂稀释法21.5.2551212864168324.12512342022/9/244药敏检测方法3、E test法2022/9/2452022/9/246药敏检测方法微量稀释法(仪器法)APIVitekBD 凤凰Maikscan等2022/9/247药物敏感试验结果解释2022/9/248参照CLSI美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）是美国国家标准协会最早认定的标

20、准制定机构，其制定的微生物临床检验标准及操作规范被视为相关检验领域的金标准。自1998年以来，卫生部将CLSI制定的药敏标准定为我国的部颁标准。药敏试验折点的建立 1. MIC的分布2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点3. 临床疗效和细菌清除率4. 抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点统计学的线性回归计算错误率：尽可能减少 极重要误差 (假敏感率)2022/9/249抑菌圈直径与MIC的关系2022/9/2501. 敏感(S) :即表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭2022/9/2512. 中介(1):“中介”类包括这些菌株，其抗微生物药物MIC接近于血液和组

21、织中通常可达到的水平，而抗微生物药治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”分类意味着药物在生理浓集的部位具有临床效力(如尿液中的哇诺酮类和-内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗(如-内酰胺类)。此分类还包括一个缓冲区，它可以避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。引进剂量依赖性敏感(SDD)的概念 2014年2022/9/252头孢吡肟肠杆菌科细菌折点2022/9/253is based on a dosage regimen of 1 g every 12 h. 2022/9/254头孢吡肟肠杆菌科细菌折点3. 耐药(R)：即表示测试菌不能

22、被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无效2022/9/255MIC愈小或抑菌圈越大越好？R不能用？，S不一定有效数据分析软件2022/9/2572022/9/25859评价药物体外抗菌活性的指标MIC50, MIC90, MIC 均值， MIC 范围，R，I，SMIC50/ MIC90：MIC从小到大排列，位于第50 / 90百分位菌株的MIC值单纯比较MIC50，MIC90是片面的，还要同时看平均MIC及MIC范围同时结合R，I，S，(不同药物血浓度不同，安全范围不同)2022/9/2第三节细菌的耐药机制及耐药性检测2022/9/260 细菌耐药的种类：固有耐药获得耐药：

23、基因突变：自发 被动，诱导基因重组 蛋白通道，反泵作用，生物膜形成， 膜通透性改变，靶位蛋白的改变， 耐药酶的产生三2022/9/265 细菌耐药机制细菌耐药机制主要有四种：产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶的改变等；细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失；细菌主动外排系统的过度表达。在上述耐药机制中，第1、2种耐药机制具有专一性，第3、4种耐药机制不具有专一性。2022/9/266-内酰胺类抗菌药作用的要点肽聚糖的合成（通过PBPs，即转肽酶和羧肽酶）和水解（通过自溶素）之间有一个脆弱的动力学平

24、衡，且一直处于周而复始的循环中-内酰胺类抗菌药通过抑制PBPs而打破这种平衡，从而激活了自溶作用2022/9/267 细菌耐药机制：获得性抗菌药灭活：最常见的耐药机制：如-内酰胺酶；转移酶2022/9/268-内酰胺酶的分类2022/9/269 -内酰胺酶 内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中； 检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。2022/9/270 一内酰胺酶头孢硝噻吩纸片法 -内酰酶阳性结果可用于预告以下几点：-内酰胺酶阳性的嗜血杆菌属、淋病奈瑟、卡他布

25、兰汉菌预告对青霉素、氨苄西林和阿莫西林耐药。-内酰胺酶阳性的葡萄球菌和肠球菌预告对青霉素和酰胺基青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素耐药。-内酰胺酶的试验结果阴性并不能排除由其他机制引起的耐药。不应对肠杆菌科、假单胞菌属及其他需氧革兰阴性杆菌进行此试验，因为试验结果不能用来预测它们对常用-内酰胺类抗生素的敏感性。 2022/9/271l -内酰胺酶试验的选择以头孢硝噻吩为底物的试验是测试嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他布兰汉菌、葡萄球菌、肠球菌的较好方法。-内酰胺酶酸度法在嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、萄球菌中测出的结果一般是可以接受的。碘试验可测试淋病奈瑟菌。但是卡他布兰汉菌只能用头孢硝噻吩试验检测。为准确

26、地检测葡萄球菌-内酰胺酶，需要对酶进行诱导，要求将头孢硝噻吩试验孵育一个小时。测试苯唑西林纸片抑菌圈边缘的生长物可以很容易地完成诱导过程。同时还要测已知阳性和阴性的质控菌株。 2022/9/272MRS发生率变迁%MRSA的定义 CLSI M100-S20(2010)MRSA就是金葡的某些菌株表达mecA基因或是其他耐甲氧西林机制，比如与青霉素结合蛋白亲和力的改变2022/9/274MRSA:甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(methecillin resistant Stphylococcus aureus)生物学特性:MRSA 是携带mecA 基因，编码低亲和力青霉素结合蛋白( PBP2a)

27、导致耐甲氧西林、所有头胞菌素、碳青霉烯类、青霉素类+青霉素酶抑制剂抗感染药物的金黄色葡萄球菌该菌是医院内感染的重要病原菌，感染多发生于免疫缺陷患者、老弱患者及手术、烧伤后的患者，极易导致感染爆发流行。2022/9/275MRSA ：医院获得性MRSA (HA - MRSA) 和社区获得性MRSA (CA- MRSA)CA -MRSA 与H - MRSA 比较主要表现HA - MRSA 通常携带SCCmec、，很少携带杀白细胞毒素( pvl) 基因而CA - MRSA 通常携带和 ， pvl 基因常阳性。在药敏谱上也有区别， CA - MRSA 为对 -内酰胺类耐药，而对多种非 -内酰胺类抗生素

28、，通常对复方磺胶、四环索和克林霉素敏感。甚至对头孢类抗生素也表现为敏感而HA - MRSA 通常呈现多重耐药。较多的研究认为， CA -MRSA 并非起源于H - MRSA ，是近年来出现的一种薪的耐药模式，在美国、澳大和亚和欧洲引起广泛重视。2022/9/276超级病菌蔓延美国致死人数超艾滋选择美国9个代表性地区在2005年的MRSA感染监控数据，严重感染MRSA 5287人。按此比例推算，美国当年感染人数为9.4万多人。调查发现所有感染MRSA病人，988人死亡，死亡率为10万分之6.3，推算全国则为1.865万人。 如果上述死亡案例全部系MRSA所致，那么美国国内由这种“超级病菌”造成的

29、死亡人数将超过艾滋病致死人数，后者在2005年的数据为1.7万左右。 2007年10月17 日 13:20 新华网，据美国医学会杂志2022/9/277CA-MRSA 美国CDC 标准， CA-MRSA 感染者不具有医院获得性MRSA 感染者的因素 ，常感染身体健康的青壮年 美国弗吉尼亚州贝德福德一名17岁高中生就因感染MRSA而死亡，21所学校停课 。 阿什顿邦兹，07年10月4日感到身体一侧疼痛就到当地一家医院就诊。 10月17日死亡。 2022/9/278中国对CA-MRSA的研究 2003-2006年1366株MRSA研究: PVL(杀白细胞毒素)阳性5株 0.37% SccmecII

30、I型 1株， IV型1株，V型2株未分型1株 菌株来源:2株:皮肤软组织感染，2株肺部感染， 1株是尿道感染2022/9/279S. aureus or S. Lugdunensis苯唑西林（OX)和头孢西丁(FOX)的检测大多市场上的鉴定系统专家规则提示“耐药”OXFOX耐药机制流行率报告-OXSS无普遍SRRmecA普遍RRSmecA(低水平表达)不常见RSRPBP改变或是大量-内酰胺酶（近似MRSA）罕见R2022/9/280首先判断是否MRSA苯唑西林 MIC 4g/ml或头孢西丁MIC 4g/ml（抑菌圈21mm）任一是：MRSA报告除ceftaroline外所有内酰胺类抗生素“耐药

31、”青霉素R无需检测头孢硝噻吩内酰胺酶耐酶青霉素：苯唑西林金黄色葡萄球菌M100-S23. Table 2C Supplemental Table 1. Page 80青霉素S做-内酰胺酶检测见下页否：非MRSA青霉素 MIC 0.12 g/ml头孢硝噻吩内酰胺酶阳性报告青霉素“耐药”头孢硝噻吩内酰胺酶阴性进行青霉素抑菌圈边缘试验模糊边缘报告青霉素“敏感”锐利边缘报告青霉素“耐药”金黄色葡萄球菌青霉素 (MIC 0.12 g/ml) 报告注释: 若常规进行纸片扩散法试验，则仅检测抑菌圈edge!M100-S23. Table 2C Supplemental Table 1. Page 80诱导-

32、内酰胺酶的检测如果青霉素的药敏结果出现以下情况，需要做诱导-内酰胺酶的检测 ：MIC 0.12 g/ml Zone diameter 29 mm 2022/9/283葡萄球菌当葡萄球菌分离株对青霉素MICs0.12g/mL 或抑菌环直径29mm，在报告青霉素结果为敏感前，应执行诱导-内酰胺酶试验。严重感染：必须做MIC和诱导-内酰胺酶试验，连续监测，也可考虑PCR检测blaZ- -内酰胺酶基因诱导生长（例如，取在MHA 或血琼脂平板孵育16-18h 后苯唑西林或头孢西丁纸片周围抑菌环边缘的生长物）2022/9/284金黄色葡萄球菌 -内酰胺酶 (BL)研究348 MSSA (低的青霉素MICs

33、) 由blaZ-PCR检测:303 PCR 阴性 45 PCR 阳性方法:青霉素 MICs-内酰胺酶表型试验头孢硝噻吩 - Cefinase头孢硝噻吩 - DryslideCloverleaf 试验青霉素抑菌圈边缘试验*Statens Serum Institut (Denmark), CDC (Atlanta), MGH (Boston)诱导-内酰胺酶试验血或MH平板传种菌株诱导: 贴纸片以诱导-内酰胺酶产生(e.g苯唑西林或头孢西丁)过夜孵育检测抑菌圈边缘的菌落假如-内酰胺酶阳性，报告青霉素耐药PosNeg金黄色葡萄球菌 纸片抑菌圈边缘试验(10 U 青霉素纸片和标准纸片扩散法试验)模糊

34、/ “沙滩样” =内酰胺酶阴性,青霉素敏感锐利 / “悬崖样” =内酰胺酶阳性,青霉素耐药S. aureus QC:阴性 - ATCC 25923阳性 - ATCC 29213 (补充QC)Reference: M100-S22. Table 2C Supplemental Table 1. Page 83Cloverleaf 试验检测-内酰胺酶阳性金葡菌5% 羊血平板S. aureus ATCC 25923 作为指示菌株1 单位青霉素纸片阴性 (青霉素敏感) 菌株某些结果难以判读Reference: CLSI Agenda Book January 2011. 菌株 A-D 均为BL 阳性A

35、BCDBL 阴性金黄色葡萄球菌3 实验室-内酰胺酶研究结果(N=348)试验敏感性特异性Cefinase77%100%Dryslide88%100%Cloverleaf100%100%Penicillin 抑菌圈边缘试验96%100%89Reference: CLSI Agenda Book January, 2011全球出现9株VRSA的特征-2022/9/290都有万古正在治疗或治疗史. 都同时伴有VRE感染或定植. 分离菌株VRSA和VRE含有同样的vanA基 因 万古替考临床治疗均无效 万古MIC16ug/ml， 替考 32 目前美国报告9例，7例在密西根州 万古霉素MICCLSI M

36、100-S20(2010)万古霉素纸片扩散法无抑菌环(=6mm)可检测含VanA的金黄色葡萄球菌分离株万古霉素抑菌环=8ug/ml的任何金黄色葡萄球菌，应送到参考实验室2022/9/291 葡萄球菌修订万古霉素MIC=g/ml 时应被送往参考实验室进一步证实S. aureus金黄色葡萄球菌 MIC 4 g/ml (2009) MIC 8 g/ml (2010-2012) 凝固酶阴性葡萄球菌 MIC 8 g/ml (2009) MIC 32 g/ml (2010-2012) 请与公共卫生部门协商！ 2022/9/292h-VISA 的概念定义对万古霉素敏感性降低的金葡菌 解释：其母代细菌对万古霉

37、素敏感（ 2mg/L），而子代中含有少量对万古霉素耐药性中介（ 4mg/L）的亚群 原因：h-VISA是 VISA 的的前体，是接受万古霉素长期治疗后逐渐产生的，随着这种持续存在的选择性压力，h-VISA 逐渐演变为VISA 现状：目前认为临床上主要是 VISA，VRSA 较少见，而 h-VISA 可能更常见，尤其在治疗失败的 MRSA 血流感染和心内膜炎患者中 刘正印. 球菌感染（专刊）, 2009 1(总4):8-9. 2022/9/293MRSA (not VISA)VISA血琼脂上48小时生长h-VISA发生发生机制 与万古霉素的暴露有关 细胞壁增厚 其他:抵抗溶葡萄球酶的耐受性增加，

38、青霉素结合蛋白改变、生长速度减慢、自溶活性下降2022/9/295高水平莫匹罗星耐药金黄色葡萄球菌200g 莫匹罗星纸片单孔256 g/ml 莫匹罗星结果：观察用透射光仔细检查抑菌环内有否轻微生长。无抑菌环 高水平莫匹罗星耐药有抑菌环 非高水平耐药256 g/ml单孔：生长= 高水平莫匹罗星耐药不生长= 非高水平耐药2022/9/296增加Linezolid耐药折点Linezolid不敏的S.aureus罕见0.05%(7 / 15,280 isolates) CLSI agenda book June 2009耐药机制已经确定 rRNA突变、介导耐药（能被质粒编码） Mendes et al

39、. 2008. Antimicrob Agents Chemother. 52:2244. 2022/9/297葡萄球菌属删除所有-内酰胺类折点除了青霉素，苯唑西林，头孢西丁，ceftaroline删除对金黄色葡萄球菌组苯唑西林纸片试验葡萄球菌属-内酰胺折点剩余青霉素 代表不稳定的青霉素酶苯唑西林 代表青霉素酶稳定的青霉素头孢西丁 替代苯唑西林ceftaroline（增加2013） 头孢烯具有抗MRSA活性MRS的治疗治疗困难 旧药 ：万古霉素或去甲万古霉素利福平 或庆大霉素 、喹诺酮类耐药性增加不推荐常规使用 。 新药 ：利奈唑胺、达托霉素 、替加环素2022/9/2100MSSA治疗 奈呋

40、西林，苯唑西林或双氯西林 头孢氨苄，头孢唑林 加-内酰胺酶抑制剂类 严重副作用：克林霉素 环丙沙星或左氧氟沙星利福平2022/9/2101-溶血链球菌青霉素敏感对于溶血群链球菌（A、B、C、G 群）：氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟、亚胺培南、厄他培南、和美罗培南。仅仅用于A 群链球菌的有：头孢克罗、头孢狄尼、头孢丙烯、头孢布烯、头孢呋辛、头孢泊肟和头孢匹林。对于以上菌群，当用于核准的适应症时，对青霉素敏感则认为对所列出的其它抗微生物药物敏感，无需再做药敏试验。2022/9/2102红霉素15ug/片

41、、 克林霉素2ug/片纸片边缘距离12mm “D Test” -溶血性链球菌、肺炎链球菌12mm孔内同时加1ug/ml红霉素 和0.5ug/ml克林霉素2022/9/2103平板：MHA+绵羊血5%“D Test” 溶血性链球菌2022/9/2104“D Test” 阴性 反应无诱导(msrA-介导的红霉素耐药)真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感2022/9/2105葡萄球菌可诱导的克林霉素耐药 (erm-介导) “D Test” 阳性 反应15 - 26 mmPhotos courtesy of J. Jorgensen and K. Fiebelkorn.“D”患者不会对克林霉素有反应-报

42、告克林霉素耐药2022/9/2106葡萄球菌l 青霉素氨苄西林耐药性由于低亲和力青霉素结合蛋白(PBPs)的产生，或者在少见情况下，由于-内酰胺酶的产生。肠球菌可以对青霉素和氨苄西林耐药。纸片扩散试验可以准确地检测出有PBPs改变的菌株耐药的肠球菌的检测2022/9/2107高水平氨基糖苷类耐药性l对氨基糖苷类高水平耐药表明当青霉素或糖肽类与一种氨基糖苷类抗生素联合用药时对该肠球菌菌株不会产生协同效果。2022/9/2108高水平氨基糖苷类耐药性特殊的高含量庆大霉素(120微克)或链霉素(300微克)的纸片可以用于筛选此类耐药性。没有抑菌圈时表明耐药，抑菌圈直径10mm时表明没有高水平耐药性。

43、对抑菌圈直径在79mm的菌株应使用稀释筛选试验进行检测对其他氨基糖苷类抗生素不必进行测试，因为它们对肠球菌的活性不如庆大霉素或链霉素。2022/9/2109庆大霉素高耐肠球菌庆大霉素120ug/片或链霉素(300 ug/片)抑菌直径6mm，7-9测MICMIC500ug/ml2022/9/2110ESBL确证试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸的复合制剂)2022/9/2111ESBLCLSI2022/9/2112ESBL2022/9/2113ESBL发生率变迁%57.944.6KPNCRE2%耐药现状环球时报特约记者李雪报道 据法新社和英国卫报2010年8月11日综合报道，

44、英国和印度研究人员本周三发表报告称，一些赴印度接受手术等治疗的患者感染了一种新型超级细菌。这种几乎对所有抗生素具有抗药性的细菌正在从南亚传向英国，可能在全世界蔓延。 2022/9/2115，意思是“新德里金属蛋白酶”，是一种超级抗药性基因。这种脱氧核糖核酸结构可以在同种甚至异种细菌之间“轻松”复制。研究人员现阶段多在大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌等细菌内发现基因。来源“羊城晚报”2022/9/2116含这种基因的细菌对几乎所有抗生素具有免疫力。就连“杀伤性较强的”碳青霉烯类抗生素也拿这类细菌束手无策。欧洲临床微生物和感染疾病学会说，预计至少年内没有抗生素可以“消灭”含基因的细菌。 来源“羊城晚报”

45、2022/9/2117耐药现状这种被称为NDM-1的超级细菌最初是在去年被英国卡迪夫大学的蒂莫西-沃尔什确认。他在一名瑞典病人身上发现了两种细菌，从中找到了NDM-1。 大多数NDM-1超级细菌出现在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中。除了替加环素和黏菌素以外，这种细菌对其它抗生素都具有抗药性。在部分患者身上，甚至这两种抗生素也不起作用。 2022/9/2118最关键的是，NDM-1超级细菌是以DNA的结构出现，被称为质体。研究人员称，它可以在细菌中自由复制和移动，从而使这种细菌拥有传播和变异的惊人潜能。研究人员说：“空中旅行和移居使这种超级细菌在不同国家和大陆之间迅速传播。其中大多数已经存在这种细菌的

46、国家尚未被发现。 2022/9/2119怀疑产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌筛选和确证试验2022/9/2120怀疑产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌筛选和确证试验厄他培南纸片 10g 或美罗培南纸片 10g(1) 用大肠埃希菌ATCC25922（指示菌）在肉汤或生理盐水和1:10 稀释盐水或肉汤中制备0.5 麦氏标准菌悬液（使用直接菌落悬液法或生长法）。 按常规纸片扩散法程序接种MHA 平板。 使平板干燥310min。在平板表面放置适当数量厄他培南或美罗培南纸片。(2)使用10l 接种环或拭子挑取在血琼脂平板过夜生长的3-5 试验菌落或QC 菌株，从纸片边缘向外划直线接种。划线至少有20-25mm 长。202

47、2/9/2121改良Hodge 试验大肠埃希菌ATCC25922大肠埃希菌ATCC25922被厄他培南抑制大肠埃希菌ATCC25922 增强生长。肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 产生碳青霉烯酶使扩散至培养基中厄他培南失活。因此，该处无足够量的厄他培南抑制大肠埃希菌ATCC25922 生长，出现抑菌环凹进现象图1. 在小的MHA 平板上进行MHT。(1)肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，阳性结果；(2)肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706， 阴性结果；(3)临床分离菌株，阳性结果。2022/9/2122改良Hodge 试验 2011改良Hodge 试验阳性：符合任意一项亚胺培南2

48、-8ug/ml美罗培南2-8ug/ml厄他培南2-4ug/ml 可报所有碳青酶希类耐药 未更改假如改良Hodge 试验阴性：检测碳青霉烯类药物MIC新标准解释2022/9/2123修订后碳青酶希类抗生素折点与剂量相关性（MICUG/ML)2022/9/2124碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的-内酰胺酶，主要分布于-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类-内酰胺酶。 碳青霉烯酶A类酶B类酶D类酶染色体编码：SME NMC IMI质粒编码：KPC GES质粒编码 OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-50 OXA-60 OXA-62金属酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制剂抑制可以被EDTA抑制金属酶