辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析

1、辅助生殖试验室技术应用相关国际共识解析 刘平 黄锦 北京大学第三医院辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第1页背景介绍试验室工作是决定ART成败关键步骤各试验室间：形态学分级标准不一致、操作步骤和时间点不一致、培养系统培养环境不一致、采取技术不一致等等，很多造成极难比较各试验室结果，也不利于取得ART良好结局综述国际领域ART试验室相关共识辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第2页背景介绍, Revised guidelines for good practice in IVF年, Consensus on embryo assessment(Istanbul ) 年, ESHRE- em

2、bryology guideline for diagnosis 年,Current issues in medically ART and genetics 年, ACE consensus meeting report 年, ESHRE task force on ethics and law22辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第3页背景介绍卵母细胞及胚胎形态学受精卵和胚胎观察时间点非男性原因ICSI辅助孵化囊胚培养PGD/PGS实时观察系统（Time-lapse imaging）统一命名培养液系统、培养环境辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第4页形态学共识由 Alpha 和 E

3、SHRE 两个学术团体胚胎学教授达成共识2月，土耳其，伊斯坦布尔此共识在年Hum Reprod, 和RBM Online同时发表这是首次由教授组推荐卵和胚胎评分共识，而且将会定时进行更新本共识仅为对卵和胚胎形态最基本描述形态评分形成国际共识有利于在“临床试验”中，将胚胎形态作为观察指标，评定IVF相关新技术和新产品本共识不限制各试验室做更细致形态描述和观察统计，换言之，全部ART试验室最少应该能提供本共识所要求形态观察内容Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第5页形态学共识应该提醒，延长对卵和胚胎观察时间会对胚胎发育潜能有不利影响相关从业人员在拟使用那些还未确定实际价

4、值其它观察伎俩时，必须先考虑其代价和是否获益全部观察必须遵照标准是将对胚胎发育有不利影响风险降低到最小Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第6页对受精卵和胚胎观察时间点共识 类 型 时 间 胚胎发育阶段以D0 2PM 受精为例受精检验 17 1原核阶段D1: 6-8AM受精卵检验23 1约50%处于原核期， 20% 处于两细胞期D1: 1-3PM早期卵裂检验26 1 ICSI28 1 IVF2-细胞期D1: 3-5PM ICSID1: 5-7PM IVFDay 2 胚胎评定44 14-细胞期D2: 9-11AMDay 3 胚胎评定68 18-细胞期D3: 9-11AM

5、Day 4 胚胎评定92 1桑葚胚期D4: 9-11AMDay 5 胚胎评定116 1囊胚期D5: 9-11AMIstanbul 共识，*观察时间点辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第7页卵母细胞形态学共识卵评分： 正常卵母细胞应该是由一个均一透明带、没有包含物透明或半透明状细胞质和一个大小适当极体所组成球形结构。 “好卵形态”: 圆形结构,透明带均质,胞质均匀，不包含其它结构, 第一极体大小适当 卵母细胞成熟包含细胞核和细胞质成熟。COC 评分： 扩张卵丘和放射冠形成透明带评分： 当前没有足够证据表明测量透明带厚度含有尤其意义 透明带情况因人而异，对于特殊患者，关注其透明带厚度和颜色Is

6、tanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第8页卵母细胞形态学共识卵周间隙 卵周隙中内含物需要引发重视，不过没有必要去统计或测量它们 当前认为除非卵周隙非常大，普通情况下没有必要过多关注极体评分 假如极体有异常大，不主张用于受精,非整倍体风险高胞质评分 granularity:异常结构，调整显微镜下可见 clustering：任意显微镜下均可见，低着床率 sER disks：异常结构，能够不用做受精；提议统计是单一还是数个sER胞质中空泡 注意有没有较大空泡(14 um in diameter)，低囊胚形成率 Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第9页

7、卵母细胞形态学共识Human Reproduction Update, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第10页受精检验及原核评分原核检验和受精观察同时进行原核评分共识: 评分等级描述1对称Z1 和 Z2 同等对称2非对称其它分布, 包含位于周围 3不正常0 或 1 NPBIstanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第11页卵裂期胚胎评定 (Days 2 and 3)分裂球细胞数 取决于“授精”后时间(小时) Day 2： 4 细胞； Day 3：8 细胞 卵裂速度过快或过慢胚胎，着床能力均下降 注意：胚胎培养体系有可能影响卵裂速度碎片形成 轻度 (25%)多核分裂球形

8、成 D2观察； 多核胚胎：着床能力下降，染色体异常机率增多，自然流产机率增加其它形态特征 细胞质中颗粒度、细胞膜外观、液泡、卵裂球3D分布等等Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第12页分裂球期胚胎评分系统共识（不包含分裂球数目）Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第13页Day 4 桑葚胚期评定胚胎致密化进入第四个分裂阶段假如有超出二分之一卵裂球没有融进去，此胚胎预后不好Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第14页 将Gardner囊胚评分体系数字化Day 5 囊胚期评定等级评定描述1早期2囊泡期3扩张期4孵化期I

9、CM1优突出，轻易分辨，细胞多而相互结合，结协力强。ICM2中轻易分辨，细胞少而涣散ICM3差难以分辨，极少细胞TE1优很多细胞形成一个致密上皮细胞层TE2中极少细胞形成一个涣散上皮细胞层TE3差极少细胞Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第15页“失去发育能力胚胎”定义和共识胚胎24h内发育停滞或全部细胞发生退化和溶解Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第16页Istanbul 共识小结希望本共识能成为全世界胚胎学家描述卵和胚胎形态“通用语言”可以了解和允许某些实验室沿用其他一些胚胎形态评分，假如这个评分不影响发展轨迹以上有关共识进展可认为

10、未来提供预后指标参数，鼓励使用同时，利用此形态共识可在发表文章时可简化形态描述随着参考新版本胚胎图谱，将促进对日常所见形态变化了解，进而改善病人结局Istanbul 共识，辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第17页IVM卵母细胞当前对于卵母细胞搜集最正确时间没有确定标准，大多数研究采取优势卵泡直接到达10mm优势卵泡直径大于13 mm 获取卵母细胞数目将会降低，这与内源性FSH支持降低后非优势卵泡闭锁相关一些操作要求子宫内膜厚度大于5 mm ，但这不是一条必须要求卵母细胞体外培养最正确体系当前还没有统一共识培养基中需要有丙酮酸、必需和非必需氨基酸，如组织培养液ASRM committee

11、opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第18页IVM卵母细胞卵母细胞成熟动力学卵巢良性肿瘤手术取得卵母细胞，体外培养0小时：均为GV28.5-31小时：60%为MI，仍无M43-46小时：M占50%50-52小时：M占80%ASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第19页IVM卵母细胞IVM适应证：OHSS风险，PCOS或者卵巢PCO改变授精方式：ICSI并非必须应该通知患者：与标准IVF相比较，IVM着床率、妊娠率均低于标准IVFASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第20页非男性

12、原因ICSI现实状况：不明原因不孕卵子质量欠佳卵子数目少高龄女性前次授精失败全部IVF周期全部采取ICSIPGD/PGS周期IVM周期解冻卵子周期ASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第21页非男性原因ICSI小结：对于男性原因不育，ICSI是一个非常有效治疗办法前次IVF授精失败或受精率低患者，采取ICSI能够提升受精率不明原因不孕患者，采取ICSI不会改进临床结局获卵数少或者女方高龄周期，采取ICSI不会改进临床结局全部患者都采取ICSI能够防止授精失败发生，不过大约每30例无需ICSI患者，才会防止1例授精失败对于IVF或者常规受精失败患者

13、,即使是与卵巢功效差相关,ICSI也能够提升受精率PGD/PGS、IVM、解冻卵周期中，能够采取ICSI总结：非男性原因不孕周期无需常规采取ICSIPGD/PGS、IVM、解冻卵周期，采取ICSI，患者会从中受益非男性原因进行ICSI，需要考虑技术安全性与花费ASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第22页辅助孵化Medline, 1966 to October 1. (Assisted OR zona hatching OR drilling OR thinning) AND (pregnancy OR implantation OR live

14、birth) AND blastocyst 2. Assisted hatching AND IVF (Humans Mesh AND English lang)证据强弱分级 A级：支持或反对该提议证据强有力 B级：支持或反对该提议证据中等强度 C级：没有足够证据来支持或反对该提议ASRM guideline, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第23页辅助孵化辅助孵化方法： 化学法（Tyrodes酸法、蛋白水解酶法）、激光法、机械法小结：没有足够证据显示辅助孵化能够提升分娩率（证据C级）对于一些预后较差患者（既往IVF失败史或预期结局不佳），辅助孵化能够轻微地提升临床妊娠率（证据A级）辅

15、助孵化造成多胎妊娠增加（证据A级），不过没有证据显示辅助孵化与单卵双胎相关（证据C级）对全部预后不良患者都提议辅助孵化，为时尚早ASRM guideline, 提议：不应该对全部进行IVF患者都常规实施辅助孵化！辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第24页囊胚培养此处囊胚培养不包含PGD/PGS用途囊胚培养序贯培养、单一培养囊胚冷冻： 玻璃化冷冻囊胚培养对子代影响 多胎、性别、表观遗传学囊胚培养对试验室要求： 场地、设施、人员、低氧培养环境ASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第25页囊胚培养小结仍有必要建立确认胚胎能够发育成囊胚标准对于“预后

16、良好”患者，移植多枚囊胚会造成多胎妊娠在非特定人群中，囊胚移植并没有比卵裂期移植增加活产率在“预后较差”患者中，囊胚移植也没有比卵裂期移植增加活产率囊胚培养周期中可用于冷冻胚胎数目降低尽管数据尚存争议，不过囊胚移植周期中单卵双胎百分比轻度增高囊胚培养轻微增加了子代安全性风险，尽管二者因果关系还未被证实ASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第26页囊胚培养结论：在“预后良好”患者中，支持囊胚移植；采取单囊胚移植能够降低多胎妊娠发生率在“预后较差”或者非特定患者中，囊胚移植妊娠率、活产率与卵裂期移植并无差异；在这些人群中，假如采取囊胚移植，没有胚胎移

17、植或可移植胚胎数目降低风险相对高于卵裂期移植ASRM committee opinion, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第27页PGD/PGS基因芯片、二代测序等技术促进PGD/PGS发展ESHRE PGD指南， Hum Reprod, Fertil Steril, PGS:一个有效挑选胚胎方法PGS:卵裂球+FISH方法逐步淘汰，更趋于滋养层活检+基因芯片/二代测序Fertil Steril, ; ESHRE, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第28页Time-lapse imaging实时观察系统非侵入性胚胎挑选方法虽未广泛使用，不过越来越受到关注欧洲7个使用Time-la

18、pse中心共同提出统一命名依据：-会议资料命名指南, Hum Rrprod, 辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第29页Time-lapse imaging时间定义t0IVF受精时间或ICSI/IMSI操作中间时间tPB2第二极体完全排出时间tPN确认受精时间tPNa原核出现时间点；tPN1a, tPN2a, tPN3a tPNf原核消失时间点；tPN1f, tPN2f tZ原核评分时间t2 to t92细胞到9细胞出现时间tSC最初出现融合时间tMf/p融合结束时间（出现囊腔前）（f: 完全融合，p：部分融合）tSB囊胚开始形成时间tByz囊胚完全形成时间（透明带变薄之前时间）（y：内细

19、胞团；z：滋养层细胞）tEyz开始扩张时间，透明带开始变薄最初时间tHNyz扩张胚结束，开始孵化时间tHDyz囊胚完全孵出时间命名指南, Hum Rrprod, online辅助生殖实验室技术应用相关国际共识解析第30页Time-lapse imaging命名指南, Hum Rrprod, online命名计算公式动态改变VPtPNf-tPNaPN连续时间ECC1t2 -tPB2第一次细胞分裂连续时间ECC2t4 -t2 cc2a=t3-t2 cc2b=t4-t2第二次细胞分裂连续时间ECC3t8 t4 cc3a=t5-t4 cc3b=t6-t4 cc3c=t7-t4 cc3d=t8-t4第三次细胞分裂连续时间S2t4 t3 细胞分裂同时化S3t8 t5 分裂模式同时化docmtMf-tSC