金银花提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的研究

1、金银花提取物体外抗甲型流感病毒FM1株的研究潘曌曌,王雪峰,闫丽娟,南春红,岳志军【摘要】目的不雅察金银花提取物体外按捺甲型流感病毒f1株的作用。要领接纳血凝试验要领,测定差异浓度金银花提取物体外和鸡胚内按捺流感病毒效价,阐发金银花提取物对病毒增殖的影响。结果与病毒比较组比力,金银花提取物组血凝效价低落,其按捺作用时间可从1h一连到24h,其对病毒的按捺作用随着药物浓度的低落而渐渐削弱；金银花提取物在100、50、25g/l时,对熏染流感病毒鸡胚具有防范和庇护治疗作用(p0.001),而在100g/l时的防范作用显着优于阳性比较病毒唑组(p0.05)。结论金银花提取物可有用按捺甲型流感病毒f1

2、株。【关键词】甲型流感病毒；金银花提取物；绿原酸；鸡胚abstrat：bjetivetbservetheeffetfextratsfrflslnieraeinhibitinginfluenzaavirusf1strain.ethdusetheethdfheagglutinatintest,deterinetheheagglutinatininhibitintiterthatextratsfrflslnieraeinhibitinginfluenzaavirusinvitrandinebrynatedegg.resultparediththentrlgrup,theheagglutinatini

3、nhibitintiterfextratsfrflslnieraegruperedegraded.thedepressanteffetkeptnfr1hurt24hur,andthedepressanteffeteredegradediththesteppingdnfthenentratin.atthenentratinf100,50,25g/l,extratsfrflslnieraehadthepreventativeeffetandtherapeutialeffetnebrynatedegginfetedbyinfluenzaavirus(p0.001).atthenentratinf10

4、0g/l,thepreventativeeffetfextratsfrflslnieraegrupasbetterthanribaviringrup(p0.05).nlusinextratsfrflslnieraeansuppressinfluenzaavirusf1strainatively.keyrds：influenzaavirus；extratsfrflslnierae；hlrgeniaid；ebrynatedegg本实行对金银花体外抗流感病毒作用举行系列研究,旨在阐发该药在中药复方银翘散中抗流感病毒作用的物质底子,为将该药及其有关复方研制成治疗病毒性呼吸道疾病的当代(复方)中药奠基基

5、矗1实行质料1.1药物及重要试剂金银花饮片购于辽宁中医药大学隶属病院门诊药局,经辽宁中医药大学中药阐发教研室张振秋传授断定为忍冬科植物忍冬的花蕾金银花。利巴韦林注射液(江苏吴中实业股份,批号060208)；绿原酸比较品(自配,浓度0.1112g/l)。1.2病毒甲型流感病毒鼠肺顺应株a/f1/47(h1n1),中国防范医学科学院病毒研究所提供,冻存于辽宁中医药大学病毒室,经鼠肺、鸡胚传代后为f19e21e32e41e5。1.3鸡胚9日龄尼克白种鸡胚,spf级,购于辽宁省益康生物成品厂。1.41%鸡红细胞悬液网罗康健公鸡血,阿氏液抗凝,生理盐水1500r/in离心洗涤3次,弃上清,以无菌生理盐水

6、配制成1%悬液,4冷藏备用1。1.5重要仪器级生物宁静柜(美国baker公司,型号：sg403txe)；高效液相色谱仪(日本岛津spd-10avp)；n-2000双通道色谱事情站(浙江大学智能信息事情研究所)；低温高速离心机(德国heraeus,型号：bifuge28rs)；台式压力蒸汽灭菌器(沈阳盛达生物电子装备)；电热恒温造就箱(上海跃进医疗东西厂)；as3120电子超声仪。2实行要领2.1金银花提取物的制备及其断定电子天平称量金银花饮片放入圆底烧瓶中,参加配制好的80%乙醇14倍量,电热套加热回流2h；第1次提取后倾倒滤液,药渣再加80%乙醇10倍量,加热回流1h；归并滤液,加热浓缩,水

7、浴箱透风橱加热挥发成膏状,置于电热烘箱内烘干,研成粉末避光冷藏备用。用于体外实行时,用生理盐水配成浓度为400g/l的溶液,高速离心机4000r/in离心30in,取上清,高温高压灭菌后4冷藏备用。精称样品粉末0.1751g,置锥形瓶中,加50%甲醇50l定容,超声30in；放冷,过滤,取续滤液5l,入棕色量瓶保存待测,检测时用0.45微孔滤膜过滤。汲取比较品溶液5l注入液相色谱仪,以乙腈-0.4%磷酸(1387)为活动相,柱温为35；流速为1.0l/in,于327n波优点检测；以绿原酸峰面积为纵坐标,绿原酸量(g)为横坐标,绘制尺度曲线,得到回归方程。并在上述色谱条件下测定比较品溶液及供试品

8、溶液的峰面积。2.2流感病毒增毒及其在鸡胚上半数熏染量的测定将病毒原液接种于局部消毒后的9日龄spf鸡胚尿囊腔,每胚接种0.1l,白腊封口,3335温箱孵育48h,4留宿。收取尿囊液,红细胞凝集试验测血凝滴度。将流感病毒原液系列对数稀释(10-110-12),别离接种在事先标识表记标帜好的鸡胚尿囊腔内,每个浓度接种4个鸡胚,并做生理盐水比较。将注射了流感病毒的鸡胚放入3335温箱内,48h后取出,放入4冰箱内留宿；收取尿囊液,每胚0.1l依次参加作好标识表记标帜的血凝板上,再参加预先配制好1%的鸡血球0.1l,轻摇后40in不雅察结果,用krber公式2盘算。测得eid50为10-6.28,实

9、行用100eid50。2.3金银花提取物最大不凝血浓度的测定中药中含有植物血凝素,在体外实行中每每引起红细胞凝集,造成假阳性结果。因此,应用血凝试验探究中药体外按捺病毒作用,必需测定中药的最大不凝血浓度以去除影响因素。处置惩罚好的药液从原浓度始,用ph值7.4的hank,s事情液2倍系列稀释6个浓度：2-12-6(40012.5g/l),别离参加等量结实血凝单元的流感病毒,3335温箱中和2h,测定血凝效价,同时设hank,s液比较和病毒比较。结果测得金银花提取物不引起血凝的最大浓度为25g/l。2.4金银花提取物及利巴韦林注射液对鸡胚最大无毒浓度的测定用含ps10%的生理盐水将药物原液作一连

10、2倍系列稀释至1512浓度,每次抽取0.2l别离接种在预先作好标识表记标帜的鸡胚上,每个浓度接种4个鸡胚,并设生理盐水比较。将接种好的鸡胚放入35温箱内孵育48h,每12h不雅察记载鸡胚存活环境,24h内殒命的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。金银花提取物的最大无毒浓度为100g/l,利巴韦林注射液最大无毒浓度为50g/l。2.5金银花提取物差异浓度、差异时间体外按捺病毒作用用ph为7.4的hank,s事情液,将金银花提取物溶液从最大不凝血浓度起作系列2倍稀释3个浓度,每个浓度4支试管,别离参加等量100eid50的流感病毒,置3335温箱中和1、4、8、14、16、24h,测各组药物差异浓度、差

11、异时间点血凝效价,同时设病毒比较和hank,s液比较。2.6金银花提取物对甲型流感病毒熏染鸡胚防范和庇护作用药物原液自td0开始2倍比稀释3个浓度(100、50、25g/l),每胚0.1l别离接种鸡胚,每个浓度8个鸡胚,37孵育2h,并设生理盐水和病毒比较；然后别离接种0.1l的100eid50的病毒悬液,放入35温箱内48h,再4留宿。抽取尿囊液,测定血凝滴度。用100eid50病毒悬液接种鸡胚,34孵育2h,再别离接种与防范实行同浓度的药液,每组8个鸡胚,并设生理盐水及病毒比较。34温箱内48h,再4留宿。抽取尿囊液,测定血凝滴度。3结果(见图1,表1表3)表1金银花提取物体外直接按捺流感

12、病毒作用(略)表2差异浓度金银花提取物对流感病毒熏染鸡胚防范作用(略)注：与病毒比较组比力,*p0.001；与病毒唑组比力,#p0.05下同。表3差异浓度金银花提取物对流感病毒熏染鸡胚治疗作用(略)在供试样品溶液色谱图中,与比较品溶液色谱图相应的位置上,有一雷同保存时间的色谱峰,经盘算金银花提取物样品中绿原酸含量为1.76%。4讨论我们的前期实行得出银翘散全方、君药组和臣药组均具有按捺流感病毒在小鼠体内增殖、庇护肺构造的作用。单味药金银花提取物抗甲型流感病毒f1株的体外实行结果表白,该药具有很强的直接杀灭甲型流感病毒f1株的作用,而且对流感病毒的防范及治疗作用结果明显。绿原酸是金银花的重要药用身分,具有明显的清热解毒和抗菌消炎作用,国度药典也以绿原酸为指标操纵含量。本实行接纳80%乙醇回流提取要领,去除部门杂质,得到金银