植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产(55张)课件

1、植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产(55张)课件植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产(55张)课件1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功地采用紫草细胞培养工业化生产紫草宁。1983年，日本三井石油化学工业公司在世界上首次成功地采用紫北京锦绣大地农业股份有限公司/index.html北京锦绣大地农业股份有限公司/i1 植物次生代谢产物概述 2 细胞的初代培养 3 高产细胞系的筛选 4 植物细胞悬浮培养方法 5 植物次生代谢物质生产1 植物次生代谢产物概述1.1 植物代谢产物（1）初生代谢：为维持植物正常的生长发育所必须的代谢。初生代谢过程中形成的各种产物为初生代谢产物。初生代谢产物不

2、稳定，在体内容易发生转化。（2）次生代谢：建立在初生代谢基础上，对于植物的正常生长发育非必需的代谢，其代谢产物为次生代谢产物，次生代谢产物是末端代谢产物，比较稳定，可以在体内积累。1.1 植物代谢产物 类别 次生代谢产物 用途 黄酮 银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病 醌 紫草宁 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 简单酚类 香豆素 香料，抗菌消炎萜 类 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗疟疾生 物 碱 长春新碱 抗癌 奎宁 抗疟疾酚类化合物 类别 次生代谢产物 用途酚类化合物长春碱： 2 million/kg长春新碱： 15million/kg长春碱： 2 million/kg 李时珍在本草纲目中所开列的189

3、2种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。天然的次生代谢产物已经超过2万种。次生代谢产物的应用：色素、香料、药物、添加剂、工业原料等。植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产(55张)课件植物细胞悬浮培养及次生代谢产物生产(55张)课件紫杉醇：二萜类化合物最早由太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分离广泛用于治疗卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等十几种癌症目前主要来源于红豆杉属植物紫杉醇简介紫杉醇：二萜类化合物紫杉醇简介市场需求抗癌一线用药销售额年增长率5亿美元 理论需求量 2g /人, 500万人/年 1000kg/年实际销量350 k

4、g/年紫杉醇供需相差十分悬殊 图1：国际紫杉醇原料药需求走势图（单位：公斤）图2：国际紫杉醇销售额（亿美元）市场需求抗癌一线用药紫杉醇供需相差十分悬殊 图1：国际紫杉醇药源问题红豆杉 主要原料植物 国家一级保护野生植物，全球十大濒危物种之一生长缓慢 分布有限 Taxol含量低 树皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500病人700岁的红豆杉惨遭剥皮药源问题红豆杉700岁的红豆杉惨遭剥皮人工栽培 采用种子繁殖、扦插等无性繁殖方法快速、大面积人工繁育红豆杉幼苗寻找红豆衫的替代物 从红豆杉非树皮部位提取 产紫杉醇的非红豆杉植物药源问题解决办

5、法（一）人工栽培药源问题解决办法（一）药源问题解决办法（二）化学合成全合成 1994年获得成功 现有六种途径半合成 以10-DAB和Baccatin 作为半合成原料获得紫杉醇药源问题解决办法（二）化学合成药源问题解决办法（三）生物方法组织和细胞培养微生物发酵生物合成 研究阶段 红豆杉生物合成途径基本明确 10种相关酶基因被克隆表达 利用基因工程手段改造红豆杉提高紫杉醇产量 药源问题解决办法（三）生物方法1.2 获得植物次生代谢产物的方法从植物中提取化学合成植物细胞大规模培养生产次生代谢产物植物细胞具有形态全能性，化学全能性（在离体的条件下可以合成整株植物能合成的物质）1.2 获得植物次生代谢产

6、物的方法从植物中提取化学合成植物细 自然植物和细胞培养的紫草宁含量比较生产方式 生产周期 紫草宁含量（干重）完整植物 23年 12植物细胞培养 3周 14 细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径：缩短周期，提高生产效率植物细胞培养生产周期为15-30d；而完整植株生长短则几个月，长则数年，如木瓜8个月，而紫草为5年易于管理，减轻劳动强度培养在无菌条件下进行，可排除病虫害干扰可探索新的合成路线，获得新的有用物质细胞培养是生产次生代谢产物的理想途径：1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小的细胞团在液体培养基中进行大规模培养的技术。1.3 植物细胞悬浮培养：即是将植物细胞或小的细胞团在液体培成功

7、的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：分散性良好，细胞团较小，一般在 3050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。细胞分裂快，均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。有效成分含量高。次生产物的产量=细胞量*细胞次生代谢产物的产率可控遗传因素决定成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：次生产物的产量=细胞 植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易聚团等特点。 植物细胞培养反应器的设计不仅要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物的积累和分离。 适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的

8、流动性和较低的剪切力。 植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易聚团等2 细胞的初始培养实验中获得适宜于悬浮培养的细胞系的过程称为细胞的初始培养。2.1建立悬浮系获取悬浮培养的细胞细胞的振荡培养酶解法愈伤组织培养法使细胞团分散促进气体交换2 细胞的初始培养获取悬浮培养的细胞细胞的振荡培养酶解法愈伤搅拌培养； 旋转振荡培养； 旋转培养培养方式：搅拌培养； 旋转振荡培养； 旋转培养2.2 建立良好的悬浮系的关键环节 1. 选择适宜的外植体双子叶植物：幼胚、成熟胚、下胚轴、叶片单子叶植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花药等2.2 建立良好的悬浮系的关键环节 2. 诱导疏松愈伤组织； 培养基 愈伤组织的异

9、质性； 继代培养 3. 选择适宜的培养基； 基本培养基+CTK/AUX+天然复合物 eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE 培养基的PH 2. 诱导疏松愈伤组织；李忠光，龚明. 2006.7李忠光，龚明. 2006.74. 悬浮培养初期的控制 转速，光，温度5. 悬浮细胞的继代与选择 继代中收集小的细胞团 条件培养基：新鲜培养基4. 悬浮培养初期的控制3 高产细胞系的筛选(P113)3.1高产细胞系 筛选的整体思路外植体愈伤组织的诱导筛选悬浮培养细胞高产细胞系筛选3 高产细胞系的筛选(P113)外植体愈伤组织的诱导筛选悬浮高产细胞系的建立高产细胞株系的特点培养细胞在遗传上应是稳定的，

10、以得到产量恒定的产物细胞生长及产物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物代谢产物要在细胞中积累，而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中高产细胞系的建立高产细胞系的筛选过程选定特定起始材料准确选择能够产生目的代谢产物的植物种类、品种或单株应尽量选择自然状态下产生天然产物的组织或器官为外植体诱导愈伤组织，并获得单细胞悬浮液诱变处理细胞悬浮液，筛选目的突变细胞通过单细胞培养突变细胞，获得突变细胞无性系（即突变细胞愈伤组织获得）高产细胞系的筛选过程高产细胞系的筛选方法目测法注意：真正的变异体or生理状态不同的细胞克隆根据单细胞克隆次生代谢产物含量进行筛选抗性筛选如：添加抗性抑制剂 庚二酸

11、-生物素诱变筛选高产细胞系的筛选方法3.2 高产系的稳定性及保存方法尽量减少继代次数，用矿物油包埋法，低温保存法（0-4），超低温保存法（-196 ）保存。同时从高产系中不断克隆形成新的高产细胞系。3.2 高产系的稳定性及保存方法4 植物细胞悬浮培养的方法悬浮培养：将游离的细胞或者细胞团按一定密度，悬浮在液体培养基中，不断搅拌或者振荡培养，使细胞快速、大量增殖。技术难点：通气、剪切力的适应性；细胞同步化控制。培养：培养基：基本培养基+CTK/AUX 培养条件：温度、氧气、PH、转速同步化控制细胞增殖的监测，适时测定细胞的数量，掌握放罐时机。4 植物细胞悬浮培养的方法4.1 细胞悬浮培养的方法(

12、P117) 分批培养法 连续培养法 半连续培养法 细胞固定化培养4.1 细胞悬浮培养的方法(P117)分批培养：把细胞分散在一定溶积的培养基中进行培养。注：中途不添加也不更换培养基设备简单，操作方便，重复性好。适合与突变体筛选和遗传转化的研究。分批培养：把细胞分散在一定溶积的培养基中进行培养。设备简单，悬浮培养细胞增殖曲线 时间（d）细胞数量123451滞后期、 2对数生长期3直线生长期 、4减缓期5静止期（1）细胞扩增生长成S形曲线（2）继代培养：要求缩短滞后期 滞后期的长短：a 继代细胞所处的生长时期；对数期 b 继代的细胞密度 104-105个/ml悬浮培养细胞增殖曲线 时间（d）细胞数

13、量123451连续培养：在培养过程中，不断向反应 器中以一定流量添加新培养基，同时以 一定流量从系统中取出培养基及培养物的方式。加入培养基排出培养基及其培养物连续培养：在培养过程中，不断向反应加入培养基排出培养基及其培半连续培养：在完成分批培养的一个周期 后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只 保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的 种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养 的方式。细胞固定化培养：将细胞固定在固相基质上，放入培养液进行培养的方式。半连续培养：在完成分批培养的一个周期悬浮培养反应器的类型： 机械搅拌式反应器 气动式反应器内循环气升式外循环气升式内循环气升式外循环气升式机械搅拌式机械搅拌

14、式内循环气升式内循环气升式外循环气升式外循环气升式4.2 培养基：与培养的细胞密度相关（1）高密度悬浮系（5*104个/ml）a 用B5，ER等专用培养基b 对传统培养基做出改良如：加大2,4-D用量；改良MS，加入VB、CH等天然复合物（2）低密度悬浮系（5*104个/ml）a 条件培养基b 向培养基中添加多种成分，尽可能满足细胞生长的需要4.2 培养基：与培养的细胞密度相关细胞同步化：同一悬浮培养体系的大多数细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。细胞培养的同步化方法：饥饿法：限制必需物质的供应抑制法：化学抑制，物理抑制分级培养：细胞分级仪4.3 悬浮细胞培养的同步化(P121)细胞同步化：

15、同一悬浮培养体系的大多数细胞都同时通过细胞周期的4.4 悬浮细胞的生长量和活力分析(P122)（1）测定悬浮细胞数量的方法：细胞计数-血球计数板 鲜重、干重的测定细胞密实体积(PVC)（2）细胞活力测定二乙酸荧光素法 （FDA）-活细胞内有荧光产生伊凡兰染色法-染色受损细胞核-死细胞相差显微镜法-胞质环流是否存在4.4 悬浮细胞的生长量和活力分析(P122) 5 植物细胞大规模培养生产次生代谢物质植物细胞大规模培养的技术要求： 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。 从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件： 1、

16、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。 2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。 3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。 5 植物细胞大规模培养生产次生代谢物质5.1 技术路线 (1) 选择适宜的外植体；诱导疏松愈伤组织； (2) 通过含量分析，选择高产细胞系 (3) 研究培养条件（达到高产、稳产）； (4) 建立悬浮细胞培养、优化培养条件 （达到高产、稳产）； (5) 小试、中试、优化培养条件； (6) 大规模培养； (7) 工业化生产，产品分离，纯化。 5.1 技术路线5.2 提高次生代谢产物产量的方法（1）筛选高产

17、细胞系 不同植物种类，不同植株及同一植株的不同部位，往往有不同的代谢能力； 通过人工诱变改良细胞系； 通过遗传改良筛选细胞系。 5.2 提高次生代谢产物产量的方法云南红豆杉东北红豆杉中国红豆杉南方红豆杉杂种红豆杉云南红豆杉东北红豆杉中国红豆杉南方红豆杉杂种红豆杉 筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高效、高产性能稳定多年，但有的植物细胞系不稳定，因此，还需要定期检测，更新细胞株系。 筛选出的高效、高产细胞株系，有的植物细胞系其高培养基的营养成分一方面要满足植物细胞的生物量增长，另一方面要使细胞能合成和积累次生产物。故在生长的第一阶段使用生长培养基；第二阶段使用生产培养基一般来说增加培养

18、基的N、P和K浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成；而激素需根据实验确定适于植物细胞悬浮培养的基础培养基主要是B5和ER （2）优化培养基 基本培养基+激素+天然复合物 培养基的营养成分一方面要满足植物细胞的生物量增长，另一方面要 （3）改善培养条件 对于任何一种细胞培养，培养条件都要通过多次的试验摸索确定。 eg: 在胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件使紫红色愈伤组织能够生成大量的花箐苷，并且低温条件下，生成量高。 （3）改善培养条件（4）培养基中添加前体物质在细胞内次生代谢物质是以初生代谢物质为原料，经过一系列的化学转化而合成的，因此，每种次生代谢产物都有一条生物合成途径

19、。前体物质：次生代谢物质生物合成途径的中间体物质 烟草愈伤组织培养中，将前体物质烟碱酸加入，会增加烟碱的生成量。（4）培养基中添加前体物质在细胞内次生代谢物质是以初生代谢 第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）； 第二步：促进次生代谢物合成，即在细胞指数生长停止期前后才更换培养基，有利于次生物质的积累。 （5）二步培养法 第一步：解决生物量生产（促进细胞分裂）； （5）二（6） 使用诱导子 诱导子是能刺激细胞合成次生产物的物质A 生物诱导子：微生物菌丝、提取物、多糖、蛋白质类等；植物细胞碎片、寡聚糖等B 非生物诱导子：辐射、金属离子（6） 使用诱导子1、最孤独的时光，会塑造最坚强的自己。2、把

20、脸一直向着阳光，这样就不会见到阴影。3、永远不要埋怨你已经发生的事情，要么就改变它，要么就安静的接受它。4、不论你在什么时候开始，重要的是开始之后就不要停止。5、通往光明的道路是平坦的，为了成功，为了奋斗的渴望，我们不得不努力。6、付出了不一定有回报，但不付出永远没有回报。7、成功就是你被击落到失望的深渊之后反弹得有多高。8、为了照亮夜空，星星才站在天空的高处。9、我们的人生必须励志，不励志就仿佛没有灵魂。10、拼尽全力，逼自己优秀一把，青春已所剩不多。11、一个人如果不能从内心去原谅别人，那他就永远不会心安理得。12、每个人心里都有一段伤痕，时间才是最好的疗剂。13、如果我不坚强，那就等着别

21、人来嘲笑。14、早晨给自己一个微笑，种下一天旳阳光。15、没有爱不会死，不过有了爱会活过来。16、失败的定义：什么都要做，什么都在做，却从未做完过，也未做好过。17、当我微笑着说我很好的时候，你应该对我说，安好就好。18、人不仅要做好事，更要以准确的方式做好事。19、我们并不需要用太华丽的语言来包裹自己，因为我们要做最真实的自己。20、一个人除非自己有信心，否则无法带给别人信心。21、为别人鼓掌的人也是在给自己的生命加油。22、失去金钱的人损失甚少，失去健康的人损失极多，失去勇气的人损失一切。23、相信就是强大，怀疑只会抑制能力，而信仰就是力量。24、那些尝试去做某事却失败的人，比那些什么也不

22、尝试做却成功的人不知要好上多少。25、自己打败自己是最可悲的失败，自己战胜自己是最可贵的胜利。26、没有热忱，世间便无进步。27、失败并不意味你浪费了时间和生命，失败表明你有理由重新开始。28、青春如此华美，却在烟火在散场。29、生命的道路上永远没有捷径可言，只有脚踏实地走下去。30、只要还有明天，今天就永远是起跑线。31、认真可以把事情做对，而用心却可以做到完美。32、如果上帝没有帮助你那他一定相信你可以。33、只要有信心，人永远不会挫败。34、珍惜今天的美好就是为了让明天的回忆更美好。35、只要你在路上，就不要放弃前进的勇气，走走停停的生活会一直继续。36、大起大落谁都有拍拍灰尘继续走。3

23、7、孤独并不可怕，每个人都是孤独的，可怕的是害怕孤独。38、宁可失败在你喜欢的事情上，也不要成功在你所憎恶的事情上。39、我很平凡，但骨子里的我却很勇敢。40、眼中闪烁的泪光，也将化作永不妥协的坚强。41、我不去想是否能够成功，既然选了远方，便只顾风雨兼程。42、宁可自己去原谅别人，莫等别人来原谅自己。43、踩着垃圾到达的高度和踩着金子到达的高度是一样的。44、每天告诉自己一次：我真的很不错。45、人生最大的挑战没过于战胜自己！46、愚痴的人，一直想要别人了解他。有智慧的人，却努力的了解自己。47、现实的压力压的我们喘不过气也压的我们走向成功。48、心若有阳光，你便会看见这个世界有那么多美好值

24、得期待和向往。49、相信自己，你能作茧自缚，就能破茧成蝶。50、不能强迫别人来爱自己，只能努力让自己成为值得爱的人。51、不要拿过去的记忆，来折磨现在的自己。52、汗水是成功的润滑剂。53、人必须有自信，这是成功的秘密。54、成功的秘密在于始终如一地忠于目标。55、只有一条路不能选择那就是放弃。56、最后的措手不及是因为当初游刃有余的自己57、现实很近又很冷，梦想很远却很温暖。58、没有人能替你承受痛苦，也没有人能抢走你的坚强。59、不要拿我跟任何人比，我不是谁的影子，更不是谁的替代品，我不知道年少轻狂，我只懂得胜者为。60、如果你看到面前的阴影，别怕，那是因为你的背后有阳光。61、宁可笑着流泪，绝不哭着后悔。62、觉得自己做得到和做不到，只在一念之间。63、跌倒，撞墙，一败涂地，都不用害怕，年轻叫你勇敢。64、做最好的今天，回顾最好的昨天，迎接最美好的明天。65、每件事情都必须有一个期限，否则，大多数人都会有多少时间就花掉多少时间。66、当你被压力压得透不过气来的时候，记住，碳正是因为压力而变成闪耀的钻石。67、现实会告诉你，不努力就会被生活给踩死。无需找什么借口，一无所有，就是拼的理由。68、人生道路，绝大多数人，绝大多数时候，人都只能靠自己。69、不是某人使你烦恼，而是你拿某人的言行来烦恼自己。70、当一个人真正觉悟的一刻，他放弃追寻外在世界的财富，而开始追寻他內心