医学第一章-血液标本采集和血涂片制备课件

1、临床检验基础血液一般检验主讲人：宫爱华（大连医科大学附属二院检验科）联系电话一章 血液标本采集和血涂片制备重点：血标本采集方法和血涂片制备技术难点：各种抗凝剂的优缺点和使用选择 第一节 血液标本采集和抗凝剂选择血标本：全血：血细胞+血浆;临床血液学检查，血细胞计数、分类和形态 学检查血浆：全血除去血细胞；血浆病理性和生理性化学成分的测定，内分泌激素、凝血因子（钙除外）、血栓和止血检查血清：离体后血液自然凝固后析出的液体成分（除纤维蛋白原等凝血因子）；临床化学和临床免疫学检查 一、采血方法 静脉采血法部位：主要是肘静脉。还可以在：手背、内踝、股静脉，幼儿可采用颈外静脉采

2、血采血器材：一次性注射器采血步骤和注意事项：止血带压迫时间不能过长；注射器和容器必须干燥采血步骤 选择适宜静脉，在臂扎上压脉带，于穿刺处皮肤做环形消毒 让病人握拳，使静脉显露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使针筒刻度向上，先以约30o角度沿静脉正面进针，穿过皮肤刺人静脉腔。 见回血后，右手固定注射器，用左手缓缓抽出注射器针栓，至所需血量后，解除压脉带，放松拳头，以消毒棉签压住穿刺孔，拔出针头 部位：中指或无名指尖内侧、耳垂；半岁以下拇指或足部，特殊人员视情况而定所用器材：采血针、吸管采血步骤及注意事项：避免交叉应严格实行一人一针制；穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响

3、检验结果。 皮肤采血法（毛细血管采血法）方法学评价 静脉采血 皮肤采血 真空采血缺点 不同抗凝剂的使用， 限制了重复实验； 价格高 改变血液性质，影 易于溶血、凝血 响有形成分的形态; 和可混入组织液 环境污染优点 标本代表性大，无 价廉、快速、操作 减少溶血，操 组织液影响，适于 简便，标本可直接 作规范，防止 临床研究，可重复 测定 交叉感染，保 实验和追加其他实 护环境 验 质量控制患者：活动情况、精神状态、药物、年龄、性别标本采集等采血：操作规范溶血：采集、转移、保管、分离血标本处理：立即送检实验结果分析：药物、饮食的影响；密切结合临床 肝素（heparin） 原理：低浓度时抑制因子a

4、、和PF3之间的作用，加强抗凝血酶（AT-）灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成,还能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子的作用；高浓度时阻断凝血酶和纤维蛋白的反应适用方法： 1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温适用范围：红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白测定、红细胞比积）和多种生化分析 枸橼酸盐（枸橼酸三钠）原理：螯合钙离子使用方法：配成109 mmol/L的浓度和血液1：9 106 mmol/L的浓度和血液1：4适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小） 物理方法抗凝脱纤维蛋白：将血液注入有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，

5、从而防止血成凝块。适用于免疫学检验和红斑性狼疮细胞检查。 血液的贮存 1. 血液标本检验前的预处理 分离血清或血浆 预温血浆或血清 分离细胞 一、血液涂片制备将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。图1-3 血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观） 血涂片质量评价均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧注意：血滴大，速度快、角度大-血膜厚一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留有空隙。 二、血液细胞染色 染料：生物学染色剂，将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。 发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被

6、染组织亲合。碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核 的染料。如亚甲蓝、天青。酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧 烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合 细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、 嗜酸性颗粒成分等。复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料 细胞染色原理： 一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等化学作用：a. 染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。b. 蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同 数量的氨基

7、（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其 它活性基团。在游离状态时， -NH2获得一个H+变成 带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。 c. 周围环境的酸碱度：如环境pHpI（ pI 为等电 点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之， pHpI，则结合碱性染料。 染色原理 细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞

8、浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 M+CL + Na+E ME + NaCL 美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞氏染料） 图1-4 瑞氏染色原理示意图 PH对细胞染色有影响 细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异

9、常，以致识别困难，甚至造成错误。 试剂 Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态， 并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。 染色方法1. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。2. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。3. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。4. 用清水冲洗，待干后镜检。 【质量控制

10、】血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。染液不能过少，以防蒸发沉淀。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料沉着。冲洗时间也不能长。染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.【染色结果评价】 正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。 染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色，染色过酸pH3.5时，则呈现一片红色，白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。 染色环境偏碱

11、：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。姬姆萨染色法 原理 吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结 果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。吉姆萨染料 1.0g 甘油 66.0ml甲醇（AR） 66.0ml染色方法 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检试剂 瑞氏-吉姆萨染色 【原理】 将瑞特染料和吉姆萨染料按一定比例混合后对细胞进行染色，其染色原理同瑞特和吉姆萨染色法，但染色效果更佳，因为其综合了瑞士和吉姆萨染色法的优点。 【试剂】瑞特染料 1.0g吉姆萨染料 0.3g甲醇 加至500ml 先将瑞特染料和吉姆萨染料充分研磨混匀，甲醇溶解倒入容器中，未溶解完的继续加入甲醇研磨，重复多次，最后把染液加至500ml。染色方法 血片加滴加染液5滴，并立即将染液盖满血膜，2min后加入pH6.4-6.8磷酸盐缓冲液（同瑞氏染液）缓冲液10滴，10min后用流水冲洗干